Wysokorozdzielcze obrazowanie konfokalne hemocytów Drosophila zakażonych patogenami

Streszczenie

Źródło: Hiroyasu, A. i inni. Ekstrakcja hemocytów z larw Drosophila melanogaster do zakażeń drobnoustrojowych i analiza. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film prezentuje wysokorozdzielcze obrazowanie konfokalne hemocytów Drosophila melanogaster zakażonych Coxiella burnetii , aby zobrazować lokalizację patogenów w 3D, umożliwiając szczegółową analizę dynamiki infekcji wewnątrzkomórkowej i interakcji gospodarz-patogen.

Protokół

1. Obrazowanie konfokalne
   1. Konfiguruj mikroskop konfokalny do trójkolorowego obrazowania DAPI (4',6-Diamidino-2-fenylindol), EGFP (wzmocnione zielone białko fluorescencyjne) oraz mCherry. Użyj następującego ustawienia: wzbudzenie DAPI (ex) 405 nm, emisja (em) 415-480 nm; EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.
   2. Umieść próbkę pod mikroskopem i skup się na niej za pomocą obiektywu o aperturze numerycznej 63X/1.4 (NA). Zlokalizuj pożądane hemocyty w polu widzenia do obrazowania.
   3. Dostosuj moc lasera i wzmocnienia detektora, aby uzyskać odpowiednią ekspozycję próbki. Sprawdź wiele płaszczyzn z, aby upewnić się, że poziom ekspozycji jest odpowiedni dla całej grubości próbki.
   4. Znajdź górne i dolne pozycje na osi z całego hemocytu. Ustaw te pozycje jako pozycję początkową i końcową dla przekroju z.
   5. Używaj tylko zoomu skanującego, aby sfotografować obszar zawierający hemocyt. Często stosuje się współczynniki powiększenia 3X.
   6. Zbierz serię obrazów w odpowiedniej rozdzielczości, np. 1024 x 1024 pikseli w płaszczyźnie x-y oraz odstępy 0,3 μm w wymiarze z.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Coxiella burnetii - mCherry	Dr Heinzen, R.
Szkło pokrywy mikroskopu	Fisher Scientific	12-545-80
4',6-diamidino-2-fenylindol	Thermo Fisher Scientific	62247
Mikroskop konfokalny	Leica	TCS SP8-X Konfokalny Laserowy Mikroskop Skanujący z Białym Światłem
Szkiełka mikroskopowe	Fisher Scientific	12-552-3