Analiza ekspresji genów w pojedynczych komórkach z patogenów ekstrahowanych roślinnie

Streszczenie

Źródło: Rufián, J. S. i in. Analiza ekspresji genów strzykawki pseudomonas w tkance roślinnej na poziomie pojedynczych komórek. J. Vis. Exp. (2022).

Ten film pokazuje metodę analizy ekspresji genów u patogennych bakterii roślinnych na poziomie pojedynczych komórek, wykorzystując fluorescencyjnie oznaczony czynnik transkrypcyjny. Obrazowanie konfokalne ujawnia heterogeniczność ekspresji genów zjadliwości, podkreślając funkcjonalną różnorodność w populacji bakterii klonalnych.

Protokół

1. Analiza pojedynczych komórek bakterii ekstrahowanych apoplastem

1. Przygotuj roztwór agarozy 1,5% w wodzie destylowanej. Po stopieniu dodaj tyle objętości, by wypełnić przestrzeń między dwoma szkiełkami mikroskopowymi ustawionymi obok siebie i połóż na nim kolejne szkiełko (Rysunek 1). Pozwól im wyschnąć przez 15 minut i ostrożnie zdejmij szkiełko umieszczone na górze. Używając ostrza, potnij agarozowy podkład na kawałki o wymiarach 5 mm x 5 mm tuż przed użyciem.
2. Równolegle wiruj 1 mL bakterii ekstrahowanej apoplastem w ilości 12 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, ostrożnie usuwaj supernatant pipetą i ponownie zawiesijuj granulat w 20 μL wody, aby skoncentrować komórki. Umieść kroplę 2 μL skoncentrowanych komórek na pokrywie 0,17 mm i przykryj ją kawałkiem agarozowego padu o wymiarach 5 mm x 5 mm, uzyskanym wcześniej w kroku 1, jak pokazano na Rysunku 1.
3. Wizualizuj przygotowanie bakteryjne pod mikroskopem konfokalnym (patrz Tabela materiałów). Aby zidentyfikować bakterie zielonofluorescencyjne, użyj lasera wzbudzającego o średnicy 488 nm oraz filtra emisyjnego o średnicy od 500 nm do 550 nm. Aby zidentyfikować wszystkie bakterie, użyj jasnego pola i połącz oba pola.
4. Przetwarzaj obrazy konfokalne za pomocą Fidżi (patrz Tabela materiałów). Aby to zrobić, użyj wtyczki MicrobeJ, aby zidentyfikować kontur komórki bakteryjnej i zmierzyć intensywność fluorescencji wewnątrz niej.
   UWAGA: Do tej analizy zaleca się pozyskiwanie obrazów z izolowanych bakterii (nie skupionych w klasterach).

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie ustawienia i przygotowania podkładu agarowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pokrywka 0,17 mm			Brak specjalnych wymagań
Metalowa siatka 1,6 x 1,6 mm	Buzifu		Siatka z włókna szklanego
Stożkowe lampy o pojemności 50 mL	Sarstedt
Agarose	Merk
Mikroskop konfokalny Stellaris	Leica Microsystems
Oprogramowanie Fiji