1. Szczepy i warunki hodowlane
UWAGA: Syntetyczna społeczność jamy ustnej składała się ze szczepów powszechnie obecnych w mikrobiomie jamy ustnej.
- Pobierz następujące szczepy z American Type Culture Collection (ATCC): Aggregatibacter actinomycetemcomitans (ATCC 43718), Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953), Porphyromonas gingivalis (ATCC 33277), Prevotella intermedia (ATCC 25611), Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sobrinus (ATCC 33478), Actinomyces naeslundii (ATCC 51655), Streptococcus gordonii (ATCC 49818), Actinomyces viscosus (ATCC 15987) oraz Streptococcus mitis (ATCC 49456).
- Pozyskaj Veillonella parvula z Instytutu Leibniza DSMZ – Niemiecka Kolekcja Mikroorganizmów i Kultur Komórkowych (DSM 2007), Streptococcus sanguinis z Kolekcji bakterii BCCM/LMG (LMG 14657) oraz użyj szczepu Streptococcus salivarius TOVE-R oraz Streptococcus oralis.
2. Rozwój wielogatunkowej społeczności reprezentatywnej dla mikrobiomu jamy ustnej
UWAGA: Stwórz syntetyczną wspólnotę, aby symulować potencjalną zdolność adhezji bakterii jamy ustnej do nabłonka jelit in vitro . Hodować bakterie na płytkach agarowych z krwią uzupełniającą 5 μg/mL hemin, 1 μg/mL menadionu oraz 5% sterylną defibrinowaną krew końską. W skrócie:
- Rozpuść 100 mg hemin w 2 mL 1 M wodorotlenku sodu (NaOH) i dodać 100 ml destylowanej wody autoklawowej. Przechowywać w ciemnym pojemniku. Sterylizuj przez filtr 0,22 μm przed dodaniem do podłoża.
- Rozpuść 100 mg menadionu w 20 ml etanolu 96%. Sterylizuj przez filtr 0,22 μm przed dodaniem do podłoża.
- Przygotuj 1 L agaru z krwi (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta i autoklawem. Pozwól mu ostygnąć, zanim dodasz krew konia i suplementy. Wymieszaj i wlej talerze.
- Przygotuj zmodyfikowany bulion Brain Heart Infusion (BHI). Po autoklawie dodaj 5 μg/mL heminu i 1 μg/mL menadionu.
- Podawaj 9 mL tego medium w tubkach Hungate i zamykaj gumowym korkiem i aluminiową nakrętką. Przepłucz rurki azotem/dwutlenkiem węgla lub N2/CO2 (90%/10%).
- Wyjmij 1 mL beztlenowego medium strzykawką i umieść go w probówce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Zbieraj pojedyncze kolonie każdego gatunku bakterii, ponownie zawieszaj w podłożu i przenosi z powrotem do beztlenowego zmodyfikowanego BHI. Inkubuj przez 48 godzin w temperaturze 37 °C, z wyjątkiem S. salivarius, który musi być wysybany przez 24 godziny.
- W razie potrzeby potwierdzić czystość kultur przed utworzeniem syntetycznej społeczności. W skrócie:
- Ekstrakt DNA z hodowli ciekłych i amplifikacja genu 16S rRNA za pomocą starterów 27F (AGAGTTTGATYMTGGCTCAG) i 1492R (TACGGYTACCTGTTACGACT) oraz następującego programu: 5 minut w 95 °C, 30 cykli 95 °C przez 1 minutę, 55 °C przez 1 minutę i 72 °C przez 1,5 minuty, a następnie ostatni krok przedłużania 5 minut w 72 °C.
- Oczyszcz produkt reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) za pomocą zestawu komercyjnego (patrz Tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.
- Przeprowadz reakcję sekwencjonowania produktów oczyszczonych w objętości 10 μL zawierającej 0,5 μL barwnika (patrz Tabela materiałów), 3,2 pmol podkładu M13f (CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC), 2,0 μL bufora sekwencjonującego 5x oraz 20 ng szablonu, używając komercyjnego systemu sekwencjonowania z zestawem (patrz Tabela materiałów).
UWAGA: Przeprowadziliśmy ten zabieg komercyjnie. - Wykonaj wyszukiwanie BLAST na wszystkich sekwencjach (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), aby określić najbliższy znany takson i porównać go z sekwencją oryginalnego szczepu za pomocą narzędzia RDP Classifier online (http://rdp.cme.msu.edu/) oraz usługi SINA Alignment (https://www.arb-silva.de/aligner/).
- Zmierz liczbę komórek na końcu inkubacji, używając cytometrii przepływowej i barwienia SYBR Green/Propidium Iodide. Rozcieńcz hodowle do 105 komórek mL-1, używając zmodyfikowanego BHI.
- Dodaj 1 mL S. mitis do 75 mL beztlenowego BHI i inkubuj aż do fazy stacjonarnej (6 h). Następnie pobierz 0,75 mL każdego rozcieńczonego szczepu i wymieszaj w warunkach beztlenowych.
- Gdy wszystkie kultury zostaną wymieszane, należy pobrać 1 ml mikrokosmu i dodać do 75 ml BHI. Inkubować syntetyczną wspólnotę pod 10% CO2, 10% wodoru (H2), 80% N przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 200 obr./min (patrz Tabela materiałów).
- Mierz gęstość komórek w 2.8. przed przedstawieniem społeczności modelu komórkowego. Skład społeczności można ocenić za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Dodatkowo wykorzystaj sekwencjonowanie amplikonu genu 16S rRNA, aby dostarczyć informacji o początkowych obecnych członkach. W przypadku protokołów potwierdzających tożsamość używaj cDNA jako szablonu, który wskazuje bakterie aktywnie transkrybujące białka, a DNA jako szablon do ujawnienia obecności lub braku szczepów.
3. Ogólne praktyki hodowli komórkowych
UWAGA: Uzyskaj linie komórkowe użyte z Europejskiej Kolekcji Autentycznych Kultur Komórkowych (Caco-2 ECACC 86010202 oraz HT29-MTX-E12 ECACC 12040401, Public Health England, Wielka Brytania). Odczynniki do hodowli komórkowych można kupić (patrz Tabela materiałów), chyba że zakreślono inaczej.
- Utrzymanie i przekazywanie linii komórkowych Caco-2 i HT29-MTXUWAGA: Komórki Caco-2 i HT29-MTX są rutynowo hodowane w kolbach do hodowli tkankowej o powierzchni 25cm 2 zawierających uzupełnione zmodyfikowane medium orła dulbecco (DMEM) (Tabela 1). Komórki są trypsynizowane, gdy osiąga się 60–70% zbiórki.
- Usuń pożywkę komórkową z kolb. Myj dwa razy z 5 mL PBS bez wapnia/magnezu (Ca++/Mg++).
- Dodaj 2 ml roztworu trypsyny o stężeniu 0,5 mg/l oraz 0,22 g/l etylendiaminowego kwasu tetraoctowego (EDTA). Rozprowadz roztwór trypsyny, delikatnie przesuwając kolbę. Wyjmij 1,5 mL roztworu trypsyny i inkubuj kolbę w 37 °C przez 10 minut.
- Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki nie są odłączone od powierzchni kolby. Inkubuj przez dodatkowe 5 minut, jeśli trzeba.
- Dodaj 5 ml podłoża z suplementacją do hodowli komórkowej do kolby, aby dezaktywować trypsynę. Pipetować w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę jednokomórkową.
- Natychmiast należy pobrać 50 μL aliquot zawiesiny ogniwowej i wymieszać ze sterylnym roztworem 0,4% Trypana w proporcji 1:1 (v/v) dla ogniw Caco-2 lub 1:5 v/v dla HT29-MTX. Mieszaj przez pipetowanie i ładuj do komory liczącej (patrz Tabela materiałów).
- Policz żywotne komórki (białe jasne komórki) pod mikroskopem (patrz instrukcje producenta).
- Nasiona w nowej kolbie o gęstości 4 x 105 komórek/ cm2 oraz 1 x 104 komórek/ cm2, odpowiednio dla Caco-2 i HT29-MTX.
UWAGA: (1) Komórki Caco-2 różnicują się i tworzą ciasne połączenia po osiągnięciu połączenia konfluentnego. Niezwykle ważne jest, aby uniknąć nadmiernego zbiegu przed trypsynizacją. Nadmierny wzrost komórek w kolbie może powodować niepowodzenie odwarstwiania komórek po trypsynizacji i/lub zgrudkowaniu. (2) Komórki HT29-MTX to komórki produkujące śluz o wysokiej aktywności metabolicznej. Te cechy mogą powodować szybkie zakwaszanie pożywki hodowli komórkowej, zwłaszcza jeśli komórki mają wysoką gęstość. Bufor 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazineethansulfonowy (HEPES) można dodać do pożywki hodowli komórkowej (Tabela 1), aby utrzymać pH w zakresie od 7 do 7,2. Jeśli pH spada, ośrodek może zostać wymieniony, gdy konfluencja jest mniejsza niż 50%. Jednak jeśli konfluencja >50%, hodowla komórkowa musi zostać podzielona.
4. Montaż modelu wielokomorowego komórka symulującego interfejs jelita z mikroorganizmem
UWAGA: Zakończ współhodowlę w studniach dwukomorowych (średnica 24 mm, pory 0,4 μm; patrz Tabela materiałów).
- Dodaj 1,5 mL kompletnego pożywki komórkowej do przedziału wierzchołkowego i 2 mL do bazalu. Preinkubuj przez 20–30 minut, aby uzyskać równomierny rozkład zawiesiny komórkowej podczas siewu.
- Trypsynizuj hodowlę komórkową Caco-2 i HT29-MTX zgodnie z rozdziałem 3. Procedura trypsynizacji musi być dokładnie wykonana, aby uzyskać jednorodny rozkład obu linii komórkowych, w zawiesie pojedynczej komórki, bez grudek.
- Policz żywotne komórki opisane w 3.1.8.
- Dostosuj gęstość komórek do 6,5 x 104 ogniw/cm 2 w proporcji 90/10 dla ogniw Caco-2/HT29-MTX.
- Ujednolic zawiesiny komórkowe i dodaj odpowiednią objętość komórek Caco-2 i HT29-MTX do wcześniej napełnionego pojemnika sterylnego z uzupełnionym pożywką do hodowli komórkowych. Usuń przedinkubowane podłoże z wierzchołkowej strony komory przez aspirację.
- Delikatnie wymieszaj zawiesinę ogniwową pipetowaniem i przelej 1,5 mL do komory wierzchołkowej wkładek komorowych. Procedura zasiewania wymaga stałej homogenizacji zawiesiny komórkowej, ponieważ komórki mają tendencję do sedymentacji. W zależności od doświadczenia użytkownika i prędkości pracy, zawiesina ogniwa musi być wymieszana po wydawaniu 1–3 dołków.
- Delikatnie przesuwaj płytki do tyłu i do przodu, a następnie z prawa na lewo (5–10 razy), aby uzyskać równomierne rozłożenie komórek w dołku. Przenieś do inkubatora i powtórz ruch płyt.
- Utrzymuj współhodowlę komórek Caco-2/HT29-MTX przez 15 dni, odświeżając przedziały wierzchołkowe i podstawne co 2 dni suplementowanym DMEM. Po tym czasie podłoże w hodowli komórkowej można zmienić na suplementowane DMEM bez stosowania antybiotyku lub roztworu przeciwmykotycznego.
- Utrzymuj system do 20–21 dni po siewie, odświeżając podłoże co 2 dni.
- Przed rozpoczęciem badania zmierz integralność bariery nabłonkowej, stosując system rezystancji elektrycznej (patrz Tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.
- Upewnij się, że urządzenie do oporu elektrycznego transepitelowego (TEER) jest w pełni naładowane (>24 godziny) przed rozpoczęciem pomiarów.
- Odłącz sprzęt TEER od zasilania i przykryj plastikową torbą autoklawową. Zrób otwór w woreczku, żeby wprowadzić elektrodę i podłączyć ją do portu wejściowego w mierniku. Przed wprowadzeniem sprzętu TEER do szafki przepływowej spryskuj 70% etanolem/wodą (v/v).
- Aby zdezynfekować elektrodę, zanurz końcówki elektrod w roztworze 70% etanolu/wody (v/v) na 15 minut. Pozwól wyschnąć na powietrzu przez 15 sekund. Przepłucz elektrodę w podgrzewanym medium komórkowym.
- Wyjmij komórki z inkubatora i pozwól komórkom osiągnąć temperaturę pokojową wewnątrz szafki przepływowej.
- Upewnij się, że licznik jest odłączony od ładowarki. Ustaw przełącznik trybu na Ohmy i włącz włącznik zasilania.
- Zmierz rezystancję ogniwa, zanurzając elektrodę z krótszą końcówką w wkładce i dłuższą końcówką wychodzącą z dołka. Trzymaj elektrodę pod kątem 90° do wkładu płyty.
5. Przeżycie bakterii po warunkach tranzytu in vitro przez przejście pokarmowy
UWAGA: Przygotuj wszystkie rozcieńczenia ultraczystą wodą. Wszystkie roztwory sterylizować filtrem przez filtr 0,22 μm i wykonać proces trawienia w warunkach sterylnych.
- Trawienie jamy ustnej:
- Włóż 3 mL społeczności bakteryjnej do 50 mL jałowej probówki, wymieszaj z 3 mL symulowanego płynu ślinowego (SSF), zawierającego (w mmol L-1): chlorek potasu (KCl), 15,1; diwodorowy fosforan potasu (KH2PO4), 3,7; wodorowęglan sodu (NaHCO3), 6,8; chlorek magnezu w heksahydracie [MgCl2(H2O)6], 0,5, węglan amonu [(NH4) CO3], 0,06; kwas solny (HCl), 1.1; Chlorek wapnia dwuwęglany [CaCl2(H2O)2], 0,75. Dodaj 75 U/mL α-amylazy z ludzkiej śliny typu IX-A oraz 2 g/L mukuiny ze świni, typ II, do SSF.
- Inkubuj mieszankę przez 2 minuty w temperaturze 37 °C i 100 obr./min. Pobierz próbkę o pojemności 2 mL do ekstrakcji DNA i ilościowej analizy cytometrii przepływowej (S1).
- Trawienie żołądka:
- Dodaj 4 mL symulowanego płynu żołądkowego (SGF), zawierającego (w mmol L-1): KCl, 6,9; KH2PO4, 0,9; NaHCO3, 25; chlorek sodu (NaCl), 47,2; MgCl2(H2O)6, 0,1; (NH4)CO3, 0,5; HCl, 15,6; CaCl2(H2O)2, 0,075. Dodatkowo SGF zawierał 2 g/L śluzu z typu II żołądka wieprzowego.
- Zmierz pH i dostosuj do pH 3 z 1 M HCl, jeśli trzeba. Inkubować w temperaturze 37 °C i 100 obr./min. Pobierz próbkę 2 mL (S2).
- Trawienie jelita cienkiego:
- Dodaj 4 mL symulowanego płynu jelitowego (SIF) zawierającego (w mmol L-1): KCl, 6,8; KH2PO4, 0,8; NaHCO3, 85; NaCl, 38,4; MgCl2(H2O)6, 0,33; HCl, 8.4; CaCl2(H2O)2, 0,3, do probówki trawiennej.
- Dostosuj pH do 7 z 1 M NaOH, jeśli trzeba. Inkubować w temperaturze 37 °C i 100 obr./min. Pobierz próbkę 2 mL (S3).
6. Zdolność kolonizacji bakterii po warunkach tranzytu in vitro przez przejście pokarmowy
- Wirówka 2 mL trawienia jelita cienkiego przez 10 minut w dawce 2 650 x g.
- Usuń supernatant i wymieszaj granulat bakteryjny z 5 mL suplementowanego DMEM bez antybiotyków i leków przeciwmykotycznych.
- Barwienie i ilościowe określenie komórek nienaruszonych/uszkodzonych za pomocą cytometru przepływowego (patrz Tabela materiałów).
- Dostosuj gęstość komórek do 10 5 żywotnych komórek/mL, rozcieńczając je suplementowanym DMEM bez antybiotyków i leków przeciwmykotycznych.
- Usuń ośrodek wierzchołkowy systemu przelewowego i dodaj 1,5 mL zawiesiny bakteryjnej. Kohodowanie systemu przez 2 godziny w ogólnych warunkach hodowli komórkowych (37 °C, wilgotność 95%, 5%CO2).
UWAGA: Ten czas może zostać wydłużony do 48 godzin, w zależności od wymaganego protokołu eksperymentalnego. Ko-hodowla może być utrzymywana w innym inkubatorze niż ten używany do rutynowej pielęgnacji komórek, aby uniknąć skażeń. - Zmierz wartości TEER po inkubacji, aby ocenić integralność bariery nabłonkowej, jak opisano w 4.11.
- Po zakończeniu czasu inkubacji usuń ośrodek wierzchołkowy i pobierz 0,5 mL do dalszych analiz (S4). Podpróbkę podłoża można wykorzystać do oceny żywotności komórek za pomocą testu dehydrogenazy mleczanowej (LDH) (patrz Tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.
- Dodaj 0,5 mL 10 mM N-acetylocyteryny do HBSS (NAC-buffer), aby rozpuścić śluz produkowany przez HT29-MTX i odzyskać przyklejone bakterie. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, pod mieszaniem (135 obr./min, patrz Tabela materiałów).
- Odzyskaj NAC-HBSS w rurce mikrowirówki (S5) i przemyj ogniwa dwukrotnie 1 mL DPBS.
- Dodaj 0,5 mL 0,5% Triton X-100 (w/v) na monowarstwy, rozbij komórki pipetowaniem, odzyskaj płyn i wizeruj przez 1 minutę. Szybkość jest kluczowa, aby nie uszkadzać komórek bakteryjnych przez detergent.
- Wiruj komórki przez 5 minut przy 2 650 x g, a następnie oddziel supernatant (S6) i granulkę (S7).
7. Analiza próbek
UWAGA: Przeanalizować pobrane próbki (S1-S7) w celu oceny żywotności bakterii i potencjału adhezji do komórek jelit, po symulowanym trawieniu przewodu pokarmowego.
- Żywotność bakterii: Przepuszczaj próbki S1-S5 dwukrotnie przez filtr 0,45 μm i ilościowo określ komórki bakteryjne za pomocą barwienia żywych/martwych komórek oraz cytometrii przepływowej, zgodnie z krokiem 2.8.
- Potencjał adhezji: Przygotuj rozcieńczenia seryjne (-1 do -8) dla S1-S6 i nanieś 10 μL do agaru krwi i zmodyfikowanych płytek BHI. Inkubuj w temperaturze 37 °C w warunkach beztlenowych przez 24–48 godzin. Nalej tę samą objętość nierozcieńczonego S7.
- Taksonomiczna identyfikacja przyklejonych bakterii:
- Wybierz pojedyncze kolonie z pętlą hodowlową i zawiesz każdą w 10 μL wody wolnej od nukleazy. Pobierz 4 μL tej zawiesiny i użyj jej jako wzorca do amplifikacji PCR genu 16S rRNA, wykorzystując prysatory i warunki opisane w 2.7.1.
- Wykonaj sekwencjonowanie zgodnie z protokołem z wersji 2.7.3 oraz walidację sekwencji za pomocą procedury zawartej w wersji 2.7.4.
- Przeprowadz dalsze analizy, takie jak całkowita ekstrakcja DNA, ilościowa i/lub sekwencjonowanie amplikonu rRNA 16S, ekstrakcja RNA oraz profilowanie transkryptomiczne według potrzeb.
UWAGA: Ilościowa analiza cytometrią przepływową została wykonana bezpośrednio po pobieraniu próbek. Jako kontrolę dla komórek przepuszczalnych przez błonę użyto próbki wystawionej na 70 °C przez 3 minuty. Szum tła oceniano poprzez pomiar płynów trawiennych lub próbek pobranych z modelu hodowli komórkowej bez udziału bakterii za pomocą cytometrii przepływowej. Każda próbka była mierzona w trzech egzemplarzach.
Tabela 1: Opis linii komórkowych i składu ośrodka do utrzymania hodowli komórkowej.
| Hodowla komórkowa | Przyczepność/zawieszenie | Medium do uprawy | Ogólne dodatki | Konkretne suplementy | Podwojenie czasu | Warunki inkubacji |
| Caco-2 (ECACC 86010202) | Zwolennik | Zmodyfikowane medium Eagle Medium (DMEM) Dulbecco o stężeniu glukozy 4,5 g/L | Inaktywowane surowicę bydła płodowego (10% v/v) Penicylina (100 U/mL)* Streptomycyna (0,1 mg/mL)* Amfoterycyna (0,0025 mg/mL)* | Glutamax (4 mM) Aminokwasy nieniezbędne (1% v/v) Pirowinian (1 mM) | 65–72 h | Inkubator 95% wilgotności i 10%CO2 CO2 (patrz Tabela materiałów) |
| HT29-MTX (ECACC 12040401) | Zwolennik | HEPES (1 mM) | 20–24 godz. |
| * Antybiotyki i leki przeciwgrzybicze zostały usunięte z podłoża do hodowli komórkowej 2 dni przed rozpoczęciem testów. |