$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Izoluj DNA genomowe z tkanek roślinnych za pomocą zestawu do ekstrakcji genomowej
- Uzyskaj tkankę liści cytrusowych, odcinając cały świeży liść z drzewa cytrusowego czystymi nożyczkami i wkładając liść do czystej plastikowej torebki na kanapki.
UWAGA: Worek z tkanką liściową należy jak najszybciej umieścić w lodówce o temperaturze 4°C lub na lodzie w izolowanym pojemniku, aby uniknąć zepsucia. - Dodaj niewielką ilość ciekłego azotu, aby schłodzić moździerz. Podczas chłodzenia użyj nożyczek, aby wyciąć mały kawałek tkanki liściowej, około 1 cala kwadratowego. Włóż przeciętą tkankę do zaprawy, aby natychmiast ją zamrozić. Dodaj więcej ciekłego azotu, jeśli trzeba.
UWAGA: Rękawice izolowane powinny być zawsze noszone podczas kontaktu z ciekłym azotem. - Szybko zmiel tkankę roślinną na drobny proszek za pomocą zaprawy. Mielę dalej, aż ciekły azot całkowicie odparuje, a pozostanie drobny zielony proszek.
- Krótko schłodzić metalową łopatkę w ciekłym azocie przez 10-15 sekund, a następnie przełóż zmieloną tkankę wewnątrz zaprawy do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, używając szpatuły.
- Dodaj 600 μL roztworu do lizy jąder (patrz Tabela materiałów) za pomocą pipety o pojemności 1000 μL. Próbkę zawiruj przez 1–3 sekundy, a następnie inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 65 °C przez 15 minut.
- Dodaj 3 μL roztworu RNazy do lizatu za pomocą pipety 10μL, odwróć probówkę 2–5 razy, aby wymieszać, i inkubuj w temperaturze 37 °C w inkubatorze szafkowym przez 15 minut.
UWAGA: Pozwól mieszance ostygnąć do temperatury pokojowej przed dalszym przygotowaniem. - Dodaj 200 μL roztworu wytrącenia białka, wiruj z dużą prędkością przez 20 sekund, a następnie wiruj przez 3 minuty w 13 000 x g, aby uzyskać twardy pellet. Podczas wirowania próbki należy dodać 600 μL izopropanolu w temperaturze pokojowej do świeżej probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
- Używając pipety 1000 μL, ostrożnie usuń supernatant z odwirowanej próbki, przenosząc go do świeżej rurki mikrowirówki 1,5 mL zawierającej izopropanol. Granulki można teraz wyrzucić.
UWAGA: Unikaj zanieczyszczenia supernatantu białkiem, zostawiając nad pelletem minimalną ilość supernatantu. - Odwróć rurkę, aż DNA stanie się widoczne jako masa nici przypominających nici, następnie wiruj w 13 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
- Przelej supernatant, dodaj 600 μL 70% etanolu do pelletu, odwróć rurkę kilkakrotnie, aby przepłukać DNA, i wiruj w 13 000 x g przez 1 minutę.
- Ostrożnie zasysaj etanol, zostawiając luźny granulek DNA, następnie otwórz i odwróć rurkę, opierając ją na chłonnym papierze. Susz na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 15 minut.
- Dodaj 100 μL roztworu rehydratacyjnego DNA do wysuszonego pelletu DNA, a następnie inkubuj DNA w kąpieli wodnej o temperaturze 65 °C przez 1 godzinę, podczas gdy mieszanie jest okresowe przez stuknięcie w rurkę.
- Włóż 1 μL oczyszczonej wody do mikrokuwety i włóż ją do spektrofotometru, aby użyć jako pustego materiału. Oblicz stężenie obecnego DNA, umieszczając 1 μL próbki w mikrokuwecie i wkładając ją do spektrofotometru. Stężenie DNA (ng/μL) można obliczyć jako (A 260 -A 320) × współczynnik rozcieńczenia × 50 ng/μL.
UWAGA: Protokół można zatrzymać tutaj. Próbkę można przechowywać w temperaturze 4 °C.