$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Podstawowe przygotowanie przed przystąpieniem do sekcji:
- Odpowiednią objętość kompletnej pożywki NSC przygotowuje się poprzez zmieszanie NeuroCult NSC Basal Medium oraz NeuroCult NSC Proliferation Supplements w stosunku 9:1.
- Pożywkę ogrzewa się w łaźni wodnej o temperaturze 37°C.
- Do celów sekcji i płukania przygotowuje się zimną minimalną pożywkę niezbędną buforowaną HEPES (HEM) z wysokim stężeniem antybiotyków (10%). Alternatywnie, do tego celu można użyć podstawowej pożywki NSC z dodatkiem antybiotyków.
- 25-30 mL zimnej pożywki HEM zawierającej antybiotyki przelewa się do sterylnych probówek 50 mL w celu zbierania embrionów.
- Kilka plastikowych szalek Petriego o średnicy 10 cm jest niezbędnych do przechowywania embrionów i mózgów podczas sekcji, a także do umieszczania wypreparowanej tkanki.
- Narzędzia chirurgiczne niezbędne do usuwania embrionów (duże nożyczki, małe nożyczki z ostrzem, duże pęsety, małe pęsety zakrzywione) lub do sekcji embrionalnego mózgu (małe pęsety, zakrzywione pęsety precyzyjne, pęsety precyzyjne pod kątem 45° oraz małe nożyczki) sterylizuje się w sterylizatorze szklanymi kuleczkami w temperaturze 250°C lub za pomocą innych dostępnych metod autoklawowania.
- Mikroskop sekcyjny przeciera się 70% alkoholem i ustawia wewnątrz dygestorium z laminarnym przepływem powietrza lub komory PC2.
2. Pobieranie mózgu myszy w 14. dniu embrionalnym (E14) i mikrodyssekcja:
- Myszkę ciążną po kontrolowanym kopulowaniu znieczula się w 14tym dniu gestacji zgodnie z zatwierdzonym w jednostce protokołem dotyczącym zwierząt.
- Wykonuje się zwichnięcie szyi, aby upewnić się, że zwierzę nie odczuwa bólu i stresu.
- Znieczuloną myszkę kładzie się na plecach na chłonnym papierze tkankowym, a brzuch płucze 70% etanolem w celu sterylizacji obszaru.
- Skórę nad brzuchem chwyta się dużym chwytakiem, a następnie skórę i leżącą pod nią powięź przecina dużymi nożyczkami, aby odsłonić jamę brzusną i rogi macicy.
- Macice usuwa się za pomocą małego chwytaka i nożyczek, a następnie przenosi do probówki stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej zimny HEM.
- Tkanki macicy przenosi się do komory z laminarnym przepływem powietrza, a następnie płucze raz lub dwa razy odpowiednią objętością świeżego, sterylnego, zimnego HEM, aby usunąć ewentualne zanieczyszczenia, takie jak krew i sierść.
- Tkanki macicy przenosi się następnie do 10-centymetrowej szalki Petriego zawierającej zimny HEM.
- Rogi macicy otwiera się za pomocą małego zakrzywionego chwytaka i nożyczek, a embriony przenosi do nowej 10-centymetrowej szalki zawierającej zimny HEM.
- Głowy embrionów oddziela się na poziomie rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym i przenosi do innej szalki Petriego zawierającej zimny HEM.
- Szalkę Petriego przenosi się pod mikroskop stereoskopowy, aby usunąć mózg z czaszki.
- Głowy uniesiono za pomocą precyzyjnego zakrzywionego chwytaka od strony brzusznej (kaudalnej) w taki sposób, aby strona grzbietowa głowy była skierowana do góry. Za pomocą mikronożyczek wykonuje się najpierw cięcie poziome nad oczami, a następnie kontynuuje się je w linii środkowej od czoła w kierunku tyłu głowy. Należy upewnić się, że cięcie przechodzi przez skórę i czaszkę, nie uszkadzając leżącego poniżej mózgu.
- Mózg usuwa się z czaszki, przesuwając krawędzie nacięcia do tyłu za pomocą zakrzywionego chwytaka. Procedurę tę powtarza się do momentu usunięcia wszystkich mózgów z czaszek.
- Mózg uniesiono stabilnie za pomocą zakrzywionego chwytaka tak, aby strona grzbietowa była skierowana do góry, a następnie za pomocą mikronożyczek wykonuje się cięcie przez korę każdej półkuli, rozciągające się od cebulek węchowych do tyłu półkuli, aby odsłonić eminencje zwojowe.
- Używając zakrzywionego chwytaka w jednej ręce i chwytaka pod kątem 45° w drugiej, rozsuwa się nacięte płaty kory i wypreparowuje eminencje zwojowe.
- Wypreparowaną tkankę umieszcza się w sterylnej 10-centymetrowej szalce Petriego i powtarza tę procedurę, aż wszystkie mózgi zostaną poddane mikrodissekcji.
- Kawałki tkanki zbiera się za pomocą 1 mL medium NSC w końcówce pipety o pojemności 1 mL i przenosi do probówki wirówki o pojemności 15 mL.
- Tkankę dysocjuje się następnie dokładnie, lecz delikatnie, dociskając końcówkę pipety do dna probówki i pipetując zawiesinę w górę i w dół. W ten sposób grudki rozpadają się na pojedyncze komórki. Pipetowanie wykonuje się 3-4 razy, aż do uzyskania zawiesiny o mlecznym wyglądzie. Następnie zawiesinę pozostawia się na 1-2 minuty, aby niedysocjowane grudki opadły na dno.
- Prawie całą zawiesinę komórkową przenosi się do innej probówki, a następnie do pozostałych grudek dodaje kolejne 1 mL medium NSC i dysocjuje je do pojedynczych komórek w opisany sposób.
- Zawartość probówek łączy się i wiruje przez 5 minut w temperaturze pokojowej przy 700 rpm (110g).
- Nadosad odsysa się próżniowo aż do samego osadu, a komórki resuspenderuje w 1 mL kompletnego medium NSC.
- Medium delikatnie pipetuje się w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę pojedynczych komórek.
- 10 μL zawiesiny komórkowej miesza się z 90 μL błękitu trypanu w celu wykonania zliczenia komórek.
- Na koniec komórki wysiewa się w gęstości 2x105 komórek/mL w kompletnym medium NSC uzupełnionym o 20 ng/mL epidermal growth factor (EGF). Do flaszek T25 używa się 5 mL medium, do T75 20 mL, a do T175 40 mL.
- Neurosfery tworzą się w ciągu 5-7 dni podczas inkubacji w 37° C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2. W ciągu 6-7 dni sfery powinny osiągnąć rozmiar od 150 do 200 mikronów i będą gotowe do pasażowania (subkultury).
3. Pasażowanie i ekspansja embrionalnych NSCs:
- Gdy neurosfery będą gotowe do pasażowania (średnica 150-200 μm), pożywkę z zawieszonymi sferami usuwa się z kolb, przenosi do sterylnej probówki do hodowli tkanek o odpowiedniej wielkości i wiruje przy 700 rpm (110 g) przez 5 min w temperaturze pokojowej.
- Nadnadkład jest odrzucany, a sfery resuspenderuje się w 1 mL 0,05% trypsyny-EDTA.
- Zawiesinę komórkową inkubuje się następnie w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 2-3 min, a następnie stosuje się taką samą objętość inhibitora trypsyny z soi, aby zatrzymać aktywność trypsyny.
- Zawiesinę komórkową delikatnie pipetuje się w górę i w dół, aby upewnić się, że trypsyna została całkowicie dezaktywowana.
- Zawiesinę komórkową wiruje się przy 700 rpm (110 g) przez 5 min. Następnie usuwa się nadnadkład, a komórki resuspenderuje się w 1 mL kompletnego pożywki dla NSC.
- 10 μL zawiesiny komórkowej miesza się z 90 μL błękitu trypanu w celu wykonania zliczania komórek.
- Komórki wysiewa się w stężeniu 5x104 komórek/mL w kompletnej pożywce dla NSC uzupełnionej o 20 ng/mL EGF do kolby do hodowli tkanek o odpowiedniej wielkości. Do kolb T25 stosuje się 5 mL pożywki, do T75 20 mL, a do T175 40 mL.
- Wtórne neurosfery formują się w ciągu 5-7 dni podczas inkubacji w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2.
4. Reprezentatywne wyniki:
W pierwotnej hodowli embrionalnych NSC większość komórek po wysiewaniu staje się hipertroficzna i przylega do naczyń hodowlanych. Podczas gdy większość komórek obumrze lub ulegnie zróżnicowaniu, po 2-3 dniach komórki proliferacyjne tworzą niewielkie skupiska, które odrywają się od podłoża (Rycina 1). Tworzenia dużych agregatów sferoidalnych w ciągu pierwszych 48 godzin hodowli nie należy mylić z sferami pierwotnymi. Formowanie się agregatów zależy głównie od ilości zanieczyszczeń i niedysocjowanych grudek tkanki w hodowli. Prawdziwe neurosfery są jasne w fazowym kontraście i stają się bardziej sferyczne wraz ze wzrostem rozmiaru (Rycina 2). Na zewnętrznej powierzchni żywych i zdrowych sfer pojawiają się małe mikrokolce (Rycina 3). Po 5-7 dniach sfery muszą być okrągłe, ale nie skompaktowane i powinny mieć średnicę od 150 do 200 μm. Jeśli neurosferom pozwoli się urosnąć zbyt dużym rozmiarom (po 9-10 dniach hodowli), mogą one tworzyć agregaty lub przybrać ciemny kolor z powodu obumarcia komórek w centrum sfer (patrz wideo). Duże neurosfery mogą z czasem zacząć różnicować się in situ (przylegając do podłoża i migrując w stronę peryferii). Trudna jest również dysocjacja dużych neurosfer i ich pasażowanie.
Rysunek 1. Pierwotna hodowla NSC E14 3 dni po wysianiu. Strzałki wskazują proliferujące klastry NSCs. Powiększenie oryginalne; 20x
Rycina 2. Pierwotna hodowla NSC E14 7 dni po wysiewaniu. Powiększenie oryginalne; 10x
Rysunek 3. Neurosfery E14 po pierwszym pasażu 5 dni po wysiewaniu. Zwróć uwagę na mikrokolce (strzałki) na obwodzie sfer. Powiększenie oryginalne; 20x