Ustanowienie hodowli embrionalnych neuralnych komórek macierzystych myszy z wykorzystaniem testu neurosferowego

Podsumowanie

Niniejszy protokół wideo demonstruje zastosowanie testu neurosfer do izolacji i ekspansji komórek macierzystych mózgu z eminencji zwojowych mózgu myszy w 14. dniu embrionalnym.

Streszczenie

U ssaków komórki macierzyste służą jako źródło niezróżnicowanych komórek, które zapewniają genezę i odnowę komórek w różnych tkankach i organach w ciągu całego życia zwierzęcia. Mogą one potencjalnie zastępować komórki utracone w procesie starzenia się organizmu, w wyniku urazów lub chorób. Istnienie neuralnych komórek macierzystych (NSCs) zostało po raz pierwszy opisane przez Reynoldsa i Weissa (1992) w dorosłym ośrodkowym układzie nerwowym (CNS) ssaka z wykorzystaniem nowatorskiego systemu hodowli bezsurowiczej, czyli testu neurosferycznego (NSA). Zastosowanie tego testu umożliwia również izolację i namnażanie NSCs z różnych obszarów embrionalnego CNS. Namnażane in vitro NSCs są wielopotencjalne i mogą dawać początek trzem głównym typom komórek CNS. Choć NSA wydaje się stosunkowo proste w wykonaniu, wymagana jest dbałość o procedury zaprezentowane w niniejszym materiale, aby uzyskać wiarygodne i spójne wyniki. W tym filmie praktycznie zaprezentowano metodę NSA w celu generowania i namnażania NSCs z tkanki mózgowej myszy w 14. dniu embrionalnym oraz podano szczegóły techniczne pozwalające na uzyskanie powtarzalnych kultur neurosfer. Procedura obejmuje pobieranie embrionów myszy E14, mikrodysekcję mózgu w celu wyizolowania wyniesień zwojowych, dysocjację pobranej tkanki w medium do NSCs w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, a na koniec wysiew komórek do hodowli NSA. Po 5-7 dniach inkubacji otrzymane pierwotne neurosfery są pasażowane, aby dalej zwiększyć liczbę NSCs na potrzeby przyszłych eksperymentów.

Protokół

1. Podstawowe przygotowanie przed przystąpieniem do sekcji:

1. Odpowiednią objętość pełnej pożywki NSC przygotowuje się poprzez zmieszanie NeuroCult NSC Basal Medium oraz NeuroCult NSC Proliferation Supplements w stosunku odpowiednio 9:1.
2. Pożywkę ogrzewa się w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C.
3. Zimną, buforowaną HEPES minimalną pożywkę niezbędną (HEM) z wysokim stężeniem antybiotyków (10%) przygotowuje się do celów sekcji i przemywania. Alternatywnie, do tego celu można użyć bazowej pożywki NSC z dodatkiem antybiotyków.
4. 25-30 mL zimnej pożywki HEM zawierającej antybiotyki przelewa się do sterylnych probówek o pojemności 50 mL w celu zbierania embrionów.
5. Kilka plastikowych szalek Petri o średnicy 10 cm jest niezbędnych do trzymania embrionów i mózgów podczas sekcji, a także do umieszczania wypreparowanej tkanki.
6. Narzędzia chirurgiczne potrzebne do usuwania embrionów (duże nożyczki, małe nożyczki z ostrzem, duża pęseta, mała pęseta zakrzywiona) lub do sekcji embrionalnego mózgu (mała pęseta, zakrzywiona pęseta precyzyjna, pęseta precyzyjna pod kątem 45° oraz małe nożyczki) sterylizuje się w sterylizatorze szklanym w temperaturze 250°C lub za pomocą innych dostępnych metod autoklawowania.
7. Mikroskop sekcyjny przeciera się 70% alkoholem i ustawia wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza lub dygestorium klasy PC2.

2. Pobieranie mózgu myszy w stadium E14 i mikrodysekcja:

1. Myszkę w ciąży po kontrolowanym kryciu znieczula się w 14^th dniu gestacji zgodnie z zatwierdzonym przez instytucję protokołem dotyczącym zwierząt.
2. Wykonuje się zwichnięcie szyi, aby upewnić się, że zwierzę nie odczuwa bólu i stresu.
3. Znieczuloną myszkę kładzie się na plecach na chłonnym papierze tkankowym, a brzuch płucze 70% etanolem w celu sterylizacji obszaru.
4. Skórę nad brzuchem chwyta się dużym pincetem, a następnie skórę i leżącą pod nią powięź przecina się dużymi nożyczkami, aby odsłonić jamę brzuszną i rogi macicy.
5. Macice usuwa się małym pincetem i nożyczkami, a następnie przenosi do probówki stożkowej o pojemności 50 ml zawierającej zimny roztwór HEM.
6. Tkanki macicy przenosi się pod dygestorium, a następnie płucze raz lub dwa razy odpowiednią objętością świeżego, sterylnego, zimnego roztworu HEM, aby usunąć ewentualne zanieczyszczenia, takie jak krew i sierść.
7. Tkanki macicy przenosi się następnie do szalki Petriego o średnicy 10 cm zawierającej zimny roztwór HEM.
8. Rogi macicy otwiera się za pomocą małego zakrzywionego pinceta i nożyczek, a zarodki przenosi do nowej szalki o średnicy 10 cm zawierającej zimny roztwór HEM.
9. Głowy zarodków oddziela się na poziomie rdzenia kręgowego szyjnego i przenosi do kolejnej szalki Petriego zawierającej zimny roztwór HEM.
10. Szalkę Petriego przenosi się pod mikroskop sekcyjny, aby usunąć mózg z czaszki.
11. Głowy utrzymuje się za pomocą cienkiego zakrzywionego pinceta od strony ogonowej w taki sposób, aby strona grzbietowa głowy była skierowana do góry. Za pomocą mikronożyczek wykonuje się najpierw cięcie poziome nad oczami, a następnie kontynuuje je w linii środkowej od czoła w stronę tyłu głowy. Należy upewnić się, że cięcie przechodzi przez skórę i czaszkę, nie uszkadzając leżącego poniżej mózgu.
12. Mózg usuwa się z czaszki, przesuwając krawędzie nacięcia ruchem wstecznym za pomocą zakrzywionego pinceta. Procedurę tę kontynuuje się do momentu usunięcia wszystkich mózgów z czaszek.
13. Mózg unieruchamia się za pomocą zakrzywionego pinceta tak, aby strona grzbietowa była skierowana do góry, a następnie za pomocą mikronożyczek wykonuje się cięcie przez korę każdej półkuli, rozciągające się od opuszki węchowej do tyłu półkuli, aby odsłonić wyniesienia zwojowe.
14. Używając zakrzywionego pinceta w jednej ręce i pinceta pod kątem 45° w drugiej, rozsuwa się nacięte płaty kory i wycina wyniesienia zwojowe.
15. Wyciętą tkankę umieszcza się w sterylnej szalce Petriego o średnicy 10 cm i powtarza tę procedurę, aż wszystkie mózgi zostaną poddane mikrodysekcji.
16. Fragmenty tkanki zbiera się za pomocą 1 mL pożywki NSC w końcówce pipety 1 mL i przenosi do probówki wirówkowej 15 mL.
17. Tkankę dysocjuje się następnie dokładnie, ale delikatnie, dociskając końcówkę pipety do dna probówki i pipetując zawiesinę w górę i w dół. W ten sposób grudki zostają rozbite na pojedyncze komórki. Pipetowanie wykonuje się 3-4 razy, aż do uzyskania zawiesiny o mlecznym wyglądzie. Następnie pozostawia się zawiesinę na 1-2 minuty, aby niedysocjowane grudki osiadły.
18. Prawie całą zawiesinę komórkową przenosi się do drugiej probówki, a następnie do pozostałych grudek dodaje kolejne 1 mL pożywki NSC i dysocjuje je do pojedynczych komórek w opisany sposób.
19. Zawartość probówek łączy się i wiruje przez 5 minut w temperaturze pokojowej przy 700rpm (110g).
20. Nadsącz odsysa się próżniowo do poziomu osadu, a komórki resuspenduje w 1 mL kompletnej pożywki NSC.
21. Pożywkę delikatnie pipetuje się w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę pojedynczych komórek.
22. 10 μL zawiesiny komórkowej miesza się z 90 μL błękitu trypanu w celu wykonania obliczeń liczby komórek.
23. Na koniec komórki wysiewa się w zagęszczeniu 2x10⁵ cells/ mL w kompletnej pożywce NSC uzupełnionej o 20ng/ mL epidermal growth factor (EGF). Do kolb T25 stosuje się 5 mL pożywki, do T75 20 mL, a do T175 40 mL.
24. Neurosfery formują się w ciągu 5-7 dni podczas inkubacji w 37° C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO₂. Po 6-7 dniach sfery powinny mieć rozmiar od 150-200 mikronów i będą gotowe do subkultury (pasażowania).

3. Pasażowanie i ekspansja embrionalnych NSCs:

1. Gdy neurosfery są gotowe do subkultury (średnica 150-200 μm), medium z zawieszonymi sferami usuwa się z kolb, przenosi do sterylnej probówki do hodowli tkankowej o odpowiedniej wielkości i wiruje przy 700 rpm (110 g) przez 5 min w temperaturze pokojowej.
2. Nadsadewkę odrzuca się, a sfery resuspenduje w 1 mL 0,05% trypsyny-EDTA.
3. Zawiesinę komórkową inkubuje się następnie w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 2-3 min, po czym stosuje się równą objętość inhibitora trypsyny z soi w celu zatrzymania aktywności trypsyny.
4. Zawiesinę komórkową delikatnie pipetuje się w górę i w dół, aby upewnić się, że trypsyna została całkowicie zniesiona.
5. Zawiesinę komórkową wiruje się przy 700 rpm (110g) przez 5 min. Następnie usuwa się nadsadewkę, a komórki resuspenduje w 1 mL kompletnego medium NSC.
6. 10 μL zawiesiny komórkowej miesza się z 90 μL błękitu trypanu w celu wykonania posiewu komórek.
7. Komórki wysiewa się w stężeniu 5x10⁴ komórek/mL w kompletnym medium NSC uzupełnionym o 20ng/mL EGF do kolby do hodowli tkankowej o odpowiedniej wielkości. Do kolb T25 stosuje się 5 mL medium, do kolb T75 20 mL, a do kolb T175 40 mL.
8. Wtórne neurosfery tworzą się w ciągu 5-7 dni podczas inkubacji w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO₂.

4. Reprezentatywne wyniki:

W pierwotnej hodowli embrionalnych NSC większość komórek stanie się hipertroficzna i przywrze do naczyń hodowlanych po wysianiu. Choć większość komórek obumrze lub ulegnie różnicowaniu, po 2-3 dniach komórki proliferujące tworzą małe skupiska, które oddzielają się od podłoża (Rycina 1). Powstawania dużych agregatów sferoidalnych w ciągu pierwszych 48 godzin hodowli nie należy mylić z sferami pierwotnymi. Tworzenie się agregatów zależy głównie od ilości zanieczyszczeń i nierozwiązanych grudek tkanki w hodowli. Prawdziwe neurosfery są jasne w kontraście fazowym i stają się bardziej sferyczne wraz ze wzrostem rozmiaru (Rycina 2). Na zewnętrznej powierzchni żywotnych i zdrowych sfer pojawiają się małe wypustki (Rycina 3). Po 5-7 dniach sfery powinny być okrągłe, ale nie zbite, a ich średnica powinna wynosić od 150 do 200 μm. Jeśli dopuści się do zbyt dużego wzrostu neurosfer (po 9-10 dniach hodowli), mogą one tworzyć agregaty lub ciemnieć z powodu obumierania komórek w centrum sfer (patrz wideo). Duże neurosfery mogą z czasem zacząć różnicować się in situ (przywierając do podłoża i migrując ku peryferiom). Trudne jest również dysocjowanie dużych neurosfer w celu ich pasażowania.

Rysunek 1. Podstawowa kultura NSC E14 3 dni po wysianiu. Strzałki wskazują proliferujące skupiska NSC. Powiększenie oryginalne; 20x

Rycina 2. Pierwotna hodowla NSC E14 7 dni po wysianiu. Powiększenie oryginalne; 10x

Rycina 3. Neurosfery E14 z pierwszego pasażu 5 dni po wysianiu. Zwróć uwagę na mikrokolce (strzałki) na obwodzie sfer. Powiększenie oryginalne: 20x

Dyskusja

Test neurosfer jest preferowaną metodą izolacji i ekspansji neuralnych komórek macierzystych ^1-5 ze względu na swoją prostotę i powtarzalność. Badanie to stanowi nieocenione narzędzie do wielkoskalowej generacji niezróżnicowanych komórek prekursorowych OUN, które mogą być wykorzystane zarówno w badaniach in vitro, jak i in vivo. Należy podkreślić, że neurosfery mogą powstawać zarówno z rzeczywistych neuralnych komórek macierzystych, jak i z bardziej ograniczonych progenitorów. W związku z tym...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Podłoże podstawowe NeuroCult NSC Basal Medium	Podłoże	Stem Cell Technologies	05700
Suplementy do proliferacji NeuroCult NSC Proliferation Supplements	Suplement do podłoża	Stem Cell Technologies	05701
%0.05 trypsyny-EDTA	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
Inhibitor trypsyny sojowej	Odczynnik	Sigma-Aldrich	T6522
Pen/Strep	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
*MEM	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	41500-018	składnik HEM
*HEPES	Odczynnik	Sigma-Aldrich	H4034	składnik HEM
*Woda destylowana	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	15230-147
Sito do komórek	Sito	BD Biosciences	352340
Kolba T25	Naczynie hodowlane	Nalge Nunc international	136196
Kolba T80	Naczynie hodowlane	Nalge Nunc international	178905
Probówki 15 ml	Naczynie hodowlane	BD Biosciences	352096
Probówki 50 ml	Naczynie hodowlane	BD Biosciences	352070
Precyzyjna pęseta zakrzywiona	Narzędzia chirurgiczne	Fine Science Tools	11251‐35
Mała precyzyjna pęseta	Narzędzia chirurgiczne	Fine Science Tools	11272‐30
Mała pęseta	Narzędzia chirurgiczne	Fine Science Tools	11050‐10
Precyzyjne nożyczki	Narzędzia chirurgiczne	World Precision Instruments, Inc.	500216
EGF	Czynnik wzrostu	R&D Systems	2028-EG
b-FGF	Czynnik wzrostu	R&D Systems	3139-FB
Heparyna	Czynnik wzrostu	Sigma-Aldrich	H4784	zrekonstytuowana w PBS
*Aby przygotować HEM, wymieszać opakowanie MEM 1×10L oraz 160ml 1M HEPES i uzupełnić objętość do 8.75 L za pomocą wody destylowanej. Ustawić końcowe pH na 7.4 i przechowywać w temperaturze 4°C.