Niniejszy film prezentuje produkcję pseudowirusów grypy w komórkach ludzkich przy użyciu transfekcji plazmidowej za pośrednictwem fosforanu wapnia, co umożliwia bezpieczne generowanie cząstek wirusowych jednego cyklu do dalszych zastosowań, takich jak testy neutralizacji przeciwciał w warunkach 2. poziomu bezpieczeństwa biologicznego.
Artykuł metodologiczny
Produkcja pseudowirusa z wykorzystaniem transfekcji plazmidowej w komórkach ludzkich
60 wyświetleń
⸱
31 sierpnia 2026
W tym artykule
Streszczenie
Protokół
1. Pakowanie pseudowirusów za pomocą transfekcji fosforanem wapnia
- Przygotować zawiesiny pojedynczych komórek HEK293FT (9 x 105 na mL) w pełnej pożywce DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (Tabela 1). Przenieść 10 mL zawiesiny pojedynczych komórek do kolby T75 i inkubować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% dwutlenku węgla (CO2) przez 20 h przed transfekcją.
UWAGA: Zaleca się stosowanie komórek HEK293FT o niskim numerze pasażu (<20 pasaży). Należy upewnić się, że monowarstwa komórkowa osiągnęła 80-90% konfluencji. - Wymienić pożywkę na 10 mL świeżej pełnej pożywki zawierającej chlorochinę (10 µM) na 2 h przed transfekcją.
- Zmieszać odczynniki i plazmidowe DNA zgodnie z Tabelą 2 i Rysunkiem 1: ddH2O (wodę dwukrotnie destylowaną), pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ8.9, 2,5 M CaCl2 (chlorek wapnia) oraz bufor 2x 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES). Delikatnie pipetować w górę i w dół 5 razy; inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 min.
- Przenieść mieszaninę do pożywki nad komórkami i delikatnie kołysać kolbą. Inkubować komórki w inkubatorze przez 15 h.
- Wymienić pożywkę na 15 mL świeżej pełnej pożywki DMEM. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 przez 65 h.
UWAGA: Kolor pożywki będzie jasnopomarańczowy lub lekko żółty, a co najmniej 80% komórek powinno wykazywać efekt cytopatyczny (CPE) w odwróconym mikroskopie świetlnym. - Zebrać nadsącz i wirować go przy 2095 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C. Zebrać nadsącz, podzielić go na alikwoty i przechowywać w temperaturze -80 °C.
Tabela 1: Skład pełnej pożywki DMEM.
| Skład pełnej pożywki DMEM | Stężenie |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | 1x |
| Płóca wołowa (FBS) | 10% |
| Penicylina(1 U/mL)/Streptomycyna | 1 μg/ mL |
Tabela 2: System pakowania pseudowirusów.
| Materiały | Stężenie | Objętość |
| 2x HEPES (pH 7.1) | -- | 675.0 μL |
| CaCl2 (2.5 M) | -- | 67.5 μL |
| ddH2O | -- | 529.2 μL |
| pCMV Δ 8.9 | 10 ng/μL | 18.9 μL |
| pCMV/R-HA | 10 ng/μL | 27.0 μL |
| pCMV/R-NA | 50 ng/μL | 13.5 μL |
| pHR-Luc | 10 ng/μL | 18.9 μL |
Wyniki
Rycina 1: Schemat transfekcji za pośrednictwem fosforanu wapnia. Niniejszy schemat służy do opisania głównych etapów transfekcji za pośrednictwem fosforanu wapnia.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Wodny chlorek wapnia | AMRESCO | 1B110-50G | Odczynnik |
| Difosforan chlorochiny | Selleck | S4157 | Odczynnik |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 1210-046 | Odczynnik |
| Płodowa surowica bydlęca | Gibco | 1600-04 | Odczynnik |
| HEK293FT | Gibco | R70-07 | Linia komórkowa |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 051-250G | Odczynnik |
| HIV-1 p24 antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801 | Zestaw odczynników |
| Luciferase assay system freezer pack | Promega | E4530 | Zestaw odczynników |
| Probówki do mikrocentryfugi 1,5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | Materiał zużywalny |
| Nunc stożkowe probówki do wirowania 15 mL | Thermo fisher scientific | 39650 | Materiał zużywalny |
| Penicylina-streptomycyna | Gibco | 15140-12 | Odczynnik |
| Końcówki do pipet (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | Materiał zużywalny |
| Końcówki do pipet (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF13-10-Q | Materiał zużywalny |
| Końcówki do pipet (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-10-Q | Materiał zużywalny |
| Pipety serologiczne (5 mL) | Thermo fisher scientific | 17035N | Materiał zużywalny |
| Pipety serologiczne (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | Materiał zużywalny |
