Namnażanie wirusów i techniki

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the isolation of Arthrobacter bacteriophages from a soil sample using enrichment and plaque assay techniques. It highlights the infection, amplification, and visualization of phages as clear lysis zones formed on a bacterial lawn.

Source: Morales Vasquez, D., et al. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the protocol for carrying out plaque assay–based viral titration for quantifying infectious virus levels in tissue sample collected from a virus–infected mouse model.

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Source: Rustad, M., et.al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the purification of bacteriophages from a suspension containing host bacterial debris using a sucrose density gradient. It shows how the density gradient separates phages by buoyant density, enabling recovery of a visible band for resuspension and further analysis.

Source: Brauer, R. et al., Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the synthesis and harvest of the influenza virus in fertilized chicken eggs. The virus is inoculated into the allantoic cavity, where it replicates in epithelial cells and buds into the allantoic fluid, which is then collected and stored for downstream applications.

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the purification of an oncolytic virus from infected mammalian cell cultures using nuclease treatment, sequential centrifugation, membrane filtration, and sucrose cushion centrifugation.

Source: Huang, D., et al. Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the step-by-step procedure for the in vitro isolation of mosquito-associated viruses from mosquito homogenates using fibroblast-like mammalian cells.

Source: Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the isolation of borrelial phage particles from a Borrelia burgdorferi suspension using polyethylene glycol-mediated phase separation. The sample is centrifuged, treated with a salt solution, and a molecular crowding agent to precipitate phages. Chloroform extraction is done to remove debris and concentrate phage particles. The purified phage...

Source: Pett, N., et al. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the purification of bacteriophages from bacterial cell lysates using sequential centrifugation, membrane filtration, chloroform extraction, centrifugal filtration, and buffer exchange to obtain a purified phage preparation.

Source: Van Lidth de Jeude, et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the process of producing viral particles through transfection of embryonic kidney cells with plasmid–polyethylenimine complexes, which leads to viral genome expression, particle assembly, and virus collection in the medium.

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp.(2018)This video demonstrates preparation of a bacteriophage lysate containing transducing particles. A donor strain is infected, plaques form, and the soft agar overlay is processed with chloroform to yield a clarified lysate for downstream analysis.

Źródło: Mackler, R. M., et al. Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes. J. Vis. Exp. (2018)W tym filmie przedstawiono oczyszczanie intasomów wirusa pienistego prototypowego (PFV) z mieszanej zawiesiny białkowo-DNA przy użyciu ekstrakcji solnej i chromatografii żelowej (SEC), co pozwala na uzyskanie aktywnych kompleksów do dalszych analiz.

Źródło: Suzuki, Y., et al. Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction. J. Vis. Exp. (2018).Niniejszy film prezentuje procedurę przygotowania próbek wirusowych do analizy za pomocą ilościowej PCR (reakcji łańcuchowej polimerazy). Próbki wirusowe i standardy RNA są rozcieńczane seryjnie, traktowane buforem z proteinazą K i inkubowane w kontrolowanych temperaturach w celu uwolnienia RNA. Przetworzone RNA jest...

Źródło: Dembowski, J. A., et al. Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins. J. Vis. Exp. (2017).W niniejszym materiale wideo zaprezentowano izolację kompleksów białko–wirusowe DNA z jąder komórkowych z wykorzystaniem chemii klik i oczyszczania za pomocą kulek magnetycznych. Protokół obejmuje znakowanie genomów wirusowych nukleotydami zmodyfikowanymi alkinią, biotynylację poprzez reakcję klik oraz wiązanie do kulek magnetycznych powlekanych...

Źródło: Ding, J. et. al., Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (2016)W niniejszym filmie przedstawiono oczyszczanie rekombinowanych cząstek wirusowych z transfektowanych ludzkich komórek nerkowych. Wirus jest uwalniany poprzez lizę w cyklach zamrażania i rozmrażania, a następnie oczyszczany przy użyciu gradientów jodiksanolu z filtracją wspomaganą kopolimerem blokowym.

Źródło: Rghei, A. D., et al. Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models. J. Vis. Exp. (2021)W niniejszym filmie zaprezentowano metodę odzyskiwania surowego wirusa towarzyszącego adenowirusom z przetransfekowanych komórek ssaków z wykorzystaniem lizy chemicznej i wirowania, co umożliwia wysokowydajną produkcję AAV na potrzeby dalszego oczyszczania i przedklinicznych zastosowań w terapii genowej.

Source: Rustad, M. et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the amplification and recovery of infectious bacteriophages from E. coli cultures. It outlines the steps for plaque isolation, phage replication, controlled lysis, and purification.

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Source: Asad, S., et al. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates antibody-dependent enhancement of Zika virus infection in human primary macrophages, using dengue antibody–virus complexes to model how cross-reactive antibodies facilitate Fcγ receptor–mediated viral entry and replication for studying infection mechanisms and immune interactions.

Source: Klaus, J. P., et al Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates how to measure arenavirus attachment to monkey kidney cells. The assay uses low temperatures to block endocytosis and isolate the virus binding step. The approach enables precise quantification of surface-bound virus particles under conditions that restrict internalization.

Source: Fernández-Fernández, R., et. al. Bacteriophage Removal from Infected Salmonella Cultures. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the use of exogenous LPS (Lipopolysaccharide) as a receptor mimic to inactivate lytic bacteriophages in Salmonella cultures. Through sequential incubation, centrifugation, and washing, phages are eliminated, resulting in a viable, phage-free bacterial suspension for downstream applications.

Źródło: Zhao, J., et al. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato. J. Vis. Exp. (2020).W tym filmie zaprezentowano wykorzystanie Agrobacterium tumefaciens do wprowadzenia konstruktu opartego na wirusie X ziemniaka (PVX) do roślin ziemniaka hodowanych in vitro w celu wywołania wirusowego wyciszania mikroRNA (VbMS). Metoda ta umożliwia systemowe tłumienie docelowego mikroRNA, co pozwala badaczom na analizę jego roli w rozwoju roślin poprzez obserwację zmian fenotypowych.

Źródło: Esposito, A. M.,et al. High-throughput Cre-Lox Activated Viral Membrane Fusion Assay to Identify Inhibitors of HIV-1 Viral Membrane Fusion. J. Vis. Exp. (2018)W niniejszym filmie zaprezentowano fluorescencyjny test kokultury służący do monitorowania transmisji wirusa między komórkami. Test wykorzystuje kasetę reporterową zmieniającą barwę z czerwonej na zieloną w celu wizualizacji fuzji błony wirusowej oraz oceny skuteczności badanych związków w blokowaniu wnikania wirusa.

Źródło: Yates, J. G. E., et al. Production of High-Titer Recombinant Newcastle Disease Virus from Allantoic Fluid. J. Vis. Exp. (2022)Film demonstruje oczyszczanie i zagęszczanie cząstek wirusa z klarownego płynu alantoidowego pobranego z zarodkowych jaj kurzych zainfekowanych wirusem. Przedstawiono serię etapów filtracji i separacji, w tym filtrację wgłębną, filtrację przepływową wzdłużną oraz ultrawirowanie w gradiencie gęstości w celu wyizolowania nienaruszonych wirusów. Frakcja bogata w...

Źródło: Otter, C. J., et al. Infection of Primary Nasal Epithelial Cells Grown at an Air-Liquid Interface to Characterize Human Coronavirus-Host Interactions. J. Vis. Exp. (2023)Niniejszy film prezentuje wzrost koronawirusa w ludzkich komórkach nabłonka nosowego hodowanych na granicy fazy powietrze-ciecz (ALI), co odwzorowuje proces infekcji i replikacji wirusa w ludzkiej jamie nosowej.

Source: Zhang, L., et al. Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts. J. Vis. Exp. (2021)The video demonstrates the preparation of gut tissue from a plant virus–infected insect vector for fluorescence imaging. Fixed guts were washed, permeabilized, and incubated with two fluorescent antibodies in a blocking solution—one targeting a viral antigen in vesicles, the other a vesicle-associated membrane protein. The tissue was counterstained for actin...

Source: Schaeffer, J. W., Chandler, et al. Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the detection of viruses from bioaerosols using an anion exchange resin. A liquid impinger containing the resin is used to capture viruses from the air. The resin is collected and treated with a virus lysis buffer containing carrier RNA. The lysate is transferred to a microcentrifuge tube for viral RNA isolation, followed by qRT-PCR to amplify...

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the process of performing a fluorescent plaque assay using recombinant vaccinia virus encoding red fluorescent protein (RFP) in fibroblast cells, followed by plaque isolation and purification for further analysis.

Source: Williams, S. M. et al. Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates tapping-mode AFM to visualize phage–antigen interactions on a mica surface. It outlines the steps for antigen immobilization, phage binding, and high-resolution nanoscale imaging.

Source: DeMarino, C., et al. Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus. J. Vis. Exp. (2019)The video demonstrates the separation of EVs from virions and other contaminants by density gradient centrifugation, followed by capture and concentration with hydrogel nanoparticles. Washed fractions are then ready for downstream identification of those enriched in EVs.

Source: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the processing of lentivirus-transduced mouse intestinal organoids for paraffin embedding, to enable their downstream analysis for assessing gene expression.

Source: Chen, H. et. al. Live Cell Imaging of the TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the preparation of luciferase-expressing breast cancer cells using recombinant adenoviruses for in vivo imaging.

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Source: Stauffer, S. et al. In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the pH-dependent disassembly of influenza A virus (IAV) cores using gradient ultracentrifugation. It outlines glycerol gradient preparation, ultracentrifugation, and how different pH conditions affect IAV core disassembly.

Source: Philip, A. A., et al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the isolation of rotavirus double-stranded RNA from clarified cell lysates. It further illustrates the separation and visualization of genome segments through polyacrylamide gel electrophoresis.

Source: Philip, A. A., et. al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates a plaque assay technique to monitor rotavirus infection in epithelial cells. Trypsin activation enhances viral entry, and staining highlights viable cells, enabling visualization of infection-induced plaques.

Source: Stauffer, S. et al., In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the effect of pH on the solubilization of influenza A viral cores. Gel electrophoresis and protein staining reveal the progressive disassembly of the core structure under acidic conditions.

Source: Moore, M. D., et al. Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity. J. Vis. Exp. (2017)The video demonstrates a protocol for monitoring the heat-induced aggregation of virus-like particles using dynamic light scattering (DLS). It begins with preparing a monodisperse suspension of purified particles. The sample is then loaded into a preheated DLS instrument. As the capsid proteins denature with heat, exposed hydrophobic regions cause particle...

Source: Tran, B. N., et. al. High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells. J. Vis. Exp. (2022)This video demonstrates the use of quantum dot–conjugated spike protein (QD-Spike) to visualize dose-dependent viral entry in ACE2-GFP–expressing cells. Confocal imaging captures the internalization of QD-Spike via receptor-mediated endocytosis, modeling early coronavirus entry.

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp.(2015)This video demonstrates the isolation of bacteriophages from a soil sample. A soil sample is collected and suspended in a phage buffer and allowed to settle the sediment. The extract is filtered, and nutrients are added. A vacuum filtration is done to remove microbial contaminants. The filtrate with phages is aliquoted into flasks, and...

Source: Allaire, A., et al. Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus. J. Vis. Exp. (2015).The video demonstrates the procedure for preparing cells to assess the intracellular uptake and activity of an antiviral agent against the hepatitis C virus.

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Źródło: Vacca, O., et al. Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease. J. Vis. Exp. (2015)W tym filmie zaprezentowano szczegółową procedurę przygotowywania kriosiekcji siatkówki myszy w celu wizualizacji przepuszczalności wirusa towarzyszącego adenowirusom przez uszkodzone bariery siatkówkowe.

Źródło: Vacca, O., et al. Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease. J. Vis. Exp. (2015).W niniejszym filmie zaprezentowano metodę dostarczania genów za pomocą AAV do siatkówki transgenicznej myszy, a następnie sekcję tkanek i barwienie w celu oceny integralności wewnętrznej błony ograniczającej.

Źródło: Moore, M. D., et al. Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity. J. Vis. Exp.(2017).Ten film demonstruje, w jaki sposób oczyszczone kapsydy wirusowe są poddawane obróbce termicznej, przygotowywane i obrazowane przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w celu ujawnienia zmian strukturalnych i uszkodzeń wywołanych ciepłem.

Źródło: Shah, R., et al. Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection. J. Vis. Exp. (2020)W niniejszym materiale wideo zaprezentowano jednoczesną wizualizację DNA, RNA oraz białka kapsydu HIV-1 w zakażonych limfocytach ludzkich z wykorzystaniem hybrydyzacji rozgałęzionego DNA (bDNA) oraz immunofluorescencji, co umożliwia szczegółową analizę etapów replikacji wirusa w poszczególnych...

Źródło: Pohl, M. O. & Stertz, S. Pomiar przywiązania i internalizacji wirusa grypy A w komórkach A549 za pomocą cytometrii przepływowej. J. Vis. Exp. (2015) Ten film demonstruje zastosowanie testu blokującego z użyciem streptawidyny w celu odróżnienia wirusa grypy związanego z powierzchnią komórki od wirusa zinternalizowanego w ludzkich komórkach nabłonkowych płuc. Porównanie sygnałów fluorescencji wykazuje, że wyższa intensywność po inkubacji wskazuje na skuteczną internalizację wirusa.

Źródło: Niu, Y. D., et al. Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings. J. Vis. Exp. (2021)W niniejszym filmie zaprezentowano test w płytce mikrotitracyjnej służący do oceny aktywności litycznej koktajli fagowych przeciwko kulturom bakteryjnym E.coli. Przedstawiono w nim, w jaki sposób zmiany gęstości optycznej pozwalają określić potencjał fagów oraz stężenie niezbędne do całkowitego zahamowania wzrostu...

Źródło: Dembowski, J. A., Deluca, N. A. Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins. J. Vis. Exp. (2017)W niniejszym filmie przedstawiono zakażanie komórek ssaków w fazie stacjonarnej wirusem HSV-1 (Herpes Simplex Virus-1), a następnie replikację genomu wirusowego przy użyciu aparatu replikacyjnego gospodarza i wirusa. Syntetyczny analog nukleozydu zostaje wbudowany w nowo syntetyzowane wirusowe DNA w celu oznakowania replikujących się genomów,...

Źródło: Hiller, T. et. al. Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2. J. Vis. Exp. (2016)W tym filmie zaprezentowano barwienie immunohistochemiczne w celu oceny transferu genów wirusowych w recelularyzowanym modelu wątroby szczura. Ekspresja reportera, potwierdzona detekcją przeciwciał i kolokalizacją z barwieniem jąder komórkowych, wskazuje na skuteczną transdukcję wirusową w komórkach.

Źródło: Bou Khalil, J. Y., et al. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016).W niniejszym filmie zaprezentowano obrazowanie cząsteczek faustowirusa z zainfekowanej hodowli ameb przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Materiał obejmuje przygotowanie siateczki, barwienie negatywne molibdanem amonu w celu zwiększenia kontrastu oraz wizualizację wirusa pod mikroskopem. Protokół kończy się pomiarem...

Źródło: Vallery, T. K. & Steitz, J. A. Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells. J. Vis. Exp. (2019)Niniejszy film demonstruje metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu wizualizacji wirusowego RNA w komórkach zainfekowanych wirusem. Przedstawia on etapy związane z hybrydyzacją sond, amplifikacją sygnału oraz obrazowaniem konfokalnym.

Źródło: Rghei, A. D., et al. Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models. J. Vis. Exp. (2021)Wideo przedstawia oczyszczanie wektorów rekombinowanego wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV) z surowego lizatu gospodarza przy użyciu macierzy powinowactwa opartej na heparynie. Cząsteczki wirusowe wiążą się z unieruchomioną heparyną, podczas gdy zanieczyszczenia są wypłukiwane. Bufor o wysokim stężeniu soli uwalnia nienaruszone wirusy,...

Source: Rustad, M., et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the synthesis of bacteriophages using a cell-free transcription–translation (TXTL) system. A master mix is prepared using a bacterial crude extract, an energy mix, an amino acid mix, an inhibitor for a DNA-degrading enzyme, and bacteriophage DNA, then incubated. The in vitro molecular machinery enables viral protein expression and DNA...

Source: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the procedure for infecting mammalian cells with green fluorescent protein (GFP)-encoding pseudovirus, monitoring viral replication and spread by fluorescence microscopy, and collecting virus-containing supernatant for downstream applications.

Source: Yuan, M., et al. A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the expansion of plaque-derived recombinant virus in adherent mammalian cells. The virus carries a fluorescent reporter in place of a virulent gene, enabling infection tracking. Infected cells are harvested for PCR verification of the genetic modification.

Source: Liu, P., et al. Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the process of isolating recombinant Aedes aegypti densovirus (rAaeDV) from infected mosquito-derived epithelial cells. The infected cells are collected and exposed to repeated freeze-thaw cycles for lysis. Lysate is centrifuged, and the supernatant containing viral particles is filtered, aliquoted, and...

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Source: Prasad, M. et al. In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in vitro transformation of murine epithelial cells through viral delivery of Cre recombinase and mutation-inducing components. It outlines the steps for Cas9 activation, cancer-gene modification, and the establishment of a tumorigenic murine cell line.

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Źródło: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021)Niniejszy film prezentuje produkcję pseudowirusów grypy w komórkach ludzkich przy użyciu transfekcji plazmidowej za pośrednictwem fosforanu wapnia, co umożliwia bezpieczne generowanie cząstek wirusowych jednego cyklu do dalszych zastosowań, takich jak testy neutralizacji przeciwciał w warunkach 2.

Źródło: Nishitsuji, H., et al. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (2017)Niniejszy film prezentuje metodę produkcji i oczyszczania rekombinowanych cząstek wirusa zapalenia wątroby typu B, co pozwala na uzyskanie bezpiecznych, pozbawionych zdolności do replikacji preparatów wirusowych do badania wczesnych etapów infekcji oraz do zastosowań w wysokoprzepustowym przesiewaniu leków przeciwwirusowych.

Źródło: Liu, P., et al. Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (2017)W niniejszym filmie zaprezentowano zastosowanie rekombinowanych densowirusów komarów kodujących mikroRNA w celu wyciszenia specyficznych genów w larwach komarów. Zainfekowane larwy we wczesnych stadiach rozwojowych produkują funkcjonalne mikroRNA, które tłumią ekspresję genu docelowego na potrzeby dalszych badań.

Źródło: Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022).W niniejszym materiale wideo przedstawiono transdukcję genetycznie zmodyfikowanych krętków z rodzaju Borrelia z wykorzystaniem nieinfekcyjnych bakteriofagów wytrąconych glikolem polietylenowym, niosących plazmid z opornością na kanamycynę. Po inkubacji z bakteriami kulturę wysiewa się na podłoże uzupełnione antybiotykiem. Przeżywają i tworzą kolonie jedynie komórki,...

Źródło: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015)W niniejszym filmie opisano transdukcję lentiwirusem organoidów jelita myszy pochodzących z zawiesiny zawierającej struktury przypominające krypty. Wykorzystując macierz błony podstawnej jako rusztowanie oraz pożywki uzupełnione czynnikami wzrostu, wprowadzane są wektory lentiwirusem w celu umożliwienia stabilnej integracji...

Źródło: Chen, H., et al. Live Cell Imaging of the TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (2018).Niniejszy film prezentuje metodę badania aktywacji szlaku SMAD w komórkach raka piersi z wykorzystaniem podwójnej infekcji adenowirusowej. Jeden wirus dostarcza konstytutywnie ekspresowany gen GFP, natomiast drugi niesie reporter RFP pod promotorem wrażliwym na SMAD. Po stymulacji TGF-beta białka SMAD ulegają aktywacji, tworząc kompleks,...

Źródło: Meister, T. L., et al. Model hodowli komórkowej do produkcji wysokomianowych zapasów wirusa zapalenia wątroby E. J. Vis. Exp. (2020).Niniejszy film demonstruje proces izolacji cząsteczek wirusa zapalenia wątroby typu E (HEV) z transfektowanych ludzkich komórek raka wątrobowokomórkowego. Pozakomórkowe cząsteczki wirusa są zbierane z przefiltrowanych nadsączów, natomiast cząsteczki wewnątrzkomórkowe są uwalniane poprzez poddanie komórek wielokrotnym cyklom zamrażania i rozmrażania. Lizat...

Źródło: Rim, Y. A., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016).Niniejszy film prezentuje generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs) z ludzkich mononuklearnych komórek krwi obwodowej z wykorzystaniem reprogramowania za pośrednictwem wirusa Sendai. Wirusowe czynniki transkrypcyjne aktywują sieci pluripotencji i supresują geny linii komórkowych, umożliwiając podzbiorowi komórek nabycie...

Źródło: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)Niniejszy film prezentuje oczyszczanie wysokopojemnych wektorów adenowirusowych z wykorzystaniem ultrawirowania w gradiencie chlorku cezu, co umożliwia oddzielenie wirionów zawierających genom do zastosowań w dostarczaniu genów, charakterystyce wektorów oraz przedklinicznych badaniach...

Źródło: Kubala, M. H. & DeClerck, Y. A. Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (2017)W tym filmie zaprezentowano generowanie linii komórkowych nowotworowych z warunkowym wyciszeniem genów (knockdown) przy użyciu systemu lentiwirusowego shRNA indukowanego tetracykliną (Tet). Przedstawiono w nim etapy transdukcji wirusowej, selekcji antybiotykowej oraz indukowanego doksycykliną...

Źródło: Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (2016)Ten film prezentuje produkcję cząsteczek rekombinowanego wirusa towarzyszącego adenowirusom poprzez transfekcję plazmidową w komórkach ssaków. Przedstawiono w nim skoordynowaną ekspresję białek Rep, Cap oraz białek pomocniczych, które napędzają replikację genomu wirusowego i składanie kapsydu w jądrze komórkowym.

Źródło: Koza, P., et al. Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach. J. Vis. Exp. (2020)Niniejszy film demonstruje dostarczanie wektorów lentiwirusowych do zapłodnionych embrionów szczura za pomocą mikroiniekcji w celu uzyskania stabilnej integracji transgenu do generowania szczurów transgenicznych.

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates a luciferase-based pseudovirus titration assay to determine the optimal target cell density for maximum infection. By comparing luminescence across cell densities, the method ensures high assay sensitivity and reproducibility for downstream applications.

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Source: Klaus, J. P. et al. Highly Sensitive Assay for Measurement of Arenavirus-cell Attachment. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the extraction of viral RNA from surface-bound virions on epithelial cells using silica spin columns. The method includes chemical lysis, RNA stabilization, and membrane-based purification for downstream quantification of virus-cell attachment.

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates the procedure for quantifying Hepatitis C viral RNA using quantitative reverse transcription PCR to measure viral load in infected cell cultures.

Source: Kadoya, S., Sano, D. Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the use of a plaque assay to assess the rotavirus growth curve. The method involves infecting host cells with diluted virus, overlaying with agarose to restrict spread, and staining to visualize plaques formed by viral replication. By counting plaque-forming units at defined time points, the resulting growth curve reveals the lag, exponential, and...

Source: Fout, G. S., Cashdollar, J. L. EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the use of a total culturable virus assay to quantify infectious viruses in water samples. It outlines host cell inoculation, observation of cytopathic effect, and statistical quantification of infectious virus concentration.

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

Źródło: Vijayraghavan, S., et al. Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).W niniejszym filmie zaprezentowano zastosowanie testu p24 ELISA do szacowania miana wirusowego wektorów lentiwirusowych. Metoda ta polega na lizie cząstek wirusowych w celu uwolnienia białka p24, jego wychwyceniu za pomocą swoistych przeciwciał oraz detekcji z wykorzystaniem układu sprzężonego z peroksydazą, który...

Źródło: Krishnamurthi, R., et al. Understanding the Impact of Temperate Bacteriophages on Their Lysogens Through Transcriptomics. J. Vis. Exp. (2024).Niniejszy film prezentuje czasowe oznaczanie liczby spontanicznej indukcji fagowej w lizogennych szczepach Pseudomonas aeruginosa poprzez ilościowe określenie liczby żywych komórek bakteryjnych (CFU) oraz zakaźnych cząstek fagowych (PFU) w czasie. Dzięki pobieraniu próbek w określonych odstępach czasu podczas wzrostu oraz analizie tworzenia...

Source: Frias-De-Diego and A., Crisci, E. Use of Crystal Violet to Improve Visual Cytopathic Effect-based Reading for Viral Titration using TCID50 Assays. J. Vis. Exp., (2022)This video demonstrates a crystal violet staining method to visualize cytopathic effects in virus-infected cell cultures. The pattern of stained and unstained wells across serial dilutions enables rapid, cost-effective estimation of the viral infectious dose.