Wyciszanie mikroRNA w roślinach ziemniaka z wykorzystaniem wirusa Potato Virus X

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Zhao, J., et al. Potato Virus X-Based microRNA Silencing (VbMS) In Potato. J. Vis. Exp. (2020).

W tym filmie zaprezentowano wykorzystanie Agrobacterium tumefaciens do wprowadzenia konstruktu opartego na wirusie X ziemniaka (PVX) do roślin ziemniaka hodowanych in vitro w celu wywołania wirusowego wyciszania mikroRNA (VbMS). Metoda ta umożliwia systemowe tłumienie docelowego mikroRNA, co pozwala badaczom na analizę jego roli w rozwoju roślin poprzez obserwację zmian fenotypowych.

Protokół

1. Wykonaj test VbMS oparty na PVX u roślin ziemniaka.

Przesadź 4-tygodniowe rośliny ziemniaka hodowane in vitro do gleby. Przesadzone rośliny zostaną poddane analizie VbMS 3–4 dni później.
Zaszczep rośliny ziemniaka Agrobacterium zawierającym plazmidy PVX-STTM (Short Tandem Target Mimic).
UWAGA: W przypadku analizy VbMS u ziemniaka infiltrację za pośrednictwem Agrobacterium oraz szczepienie metodą zarysowania wykałaczką wykonuje się jednocześnie.
1. Wybierz i zaszczep pozytywne transformanty zawierające wektory PVX-STTM do 50 mL płynnej pożywki LB zawierającej 50 μg/mL kanamycyny i 50 μg/mL rifampicyny. Hoduj w inkubatorze w temperaturze 28 °C przy 20 rpm przez 16 h, aż do uzyskania OD₆₀₀ = 1.0.
2. Jednocześnie wymaż pozytywne kolonie Agrobacterium na co najmniej dwie nowe płytki LB zawierające 50 μg/mL kanamycyny i 50 μg/mL rifampicyny i hoduj w 28 °C przez 1 dzień. Uwzględnij wektor PVX-LIC jako kontrolę oraz PVX-GFP w celu monitorowania rozprzestrzeniania się wirusa.
3. Zbierz płynną kulturę Agrobacterium poprzez wirowanie przy 3,40 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej. Resuspenduj komórki Agrobacterium w równymt objętości bufora do infiltracji (10 mM MgCl₂, 10 mM MES i 20 µM acetosyringonu, pH = 5.6) i dostosuj do OD₆₀ = 1.0. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 6 h.
4. Infiltruj kulturę Agrobacterium do strony abaksjalnej w pełni rozwiniętych liści za pomocą strzykawki 1 mL bez igły.
  1. Odwróć i przytrzymaj liść jedną ręką, a następnie jednym palcem podeprzyj blaszkę liściową od strony adaksjalnej w miejscu infiltracji. Trzymając strzykawkę prostopadle do powierzchni liścia drugą ręką, infiltruj kulturę Agrobacterium do strony abaksjalnej blaszki.
5. Zbierz kulturę Agrobacterium z płytek LB i zarysuj powierzchnię łodygi pierwszego lub dwóch pierwszych międzywęźli zinfiltrowanych roślin ziemniaka wykałaczką. Delikatnie zarysuj naskórek łodygi. Unikaj przebicia łodygi na wylot, co mogłoby spowodować poważne uszkodzenie roślin.
Hoduj zinfiltrowane rośliny w szklarni w temperaturze 2 °C, przy fotoperiodzie 16 h światła/8 h ciemności i natężeniu światła 120 μmol/m²∙ s¹.
UWAGA: Fenotypy wywołane wyciszaniem miRNA pojawiają się zazwyczaj w ciągu 2–4 tygodni po inokulacji (Rysunek 1, Rysunek 2). Zazwyczaj pojawienie się fenotypu VbMS po infiltracji trwa od 10 do 20 dni. Fenotyp VbMS zależy od właściwości konkretnego miRNA i genów docelowych, warunków wzrostu oraz odmian ziemniaka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 1: VbMS miR165/16 w tetraploidalnej odmianie ziemniaka Katahdin. Fenotypy roślin ziemniaka (Katahdin) wykazujących ekspresję kontrolnego wektora PVX lub PVX-STTM165/16. Purpurowe strzałki wskazują ektopicznie powstałe struktury liści...