Przygotowanie kriosiekcji siatkówki myszy w celu oceny przepuszczalności siatkówki dla wirusa towarzyszącego adenowirusom

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Vacca, O., et al. Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease. J. Vis. Exp. (2015)

W tym filmie zaprezentowano szczegółową procedurę przygotowywania kriosiekcji siatkówki myszy w celu wizualizacji przepuszczalności wirusa towarzyszącego adenowirusom przez uszkodzone bariery siatkówkowe.

Protokół

Wszystkie procedury obejmujące próbki zwierzęce zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez odpowiednią komisję etyczną ds. zwierząt.

W przypadku kriosiekcji siatkówki (Rycina 1), przeprowadzić sekcję enukleowanych oczu w celu usunięcia soczewki i rogówki, a następnie utrwalić metodą imersyjną w 4% paraformaldehydzie przez 1 hr.
1. Krioprotekcję wcześniej utrwalonych oczu przeprowadzić w 10% sacharozie przez 1 hr w temperaturze pokojowej, a następnie w 20% sacharozie przez kolejną godzinę w temperaturze pokojowej. Krioprotekcję w 30% roztworze sacharozy przeprowadzić przez noc w temperaturze 4 °C. Zamrozić i zatopić gałki oczne w żywicy do zatapiania, takiej jak Cryo-matrix. Wykonać kriosiekcje o grubości 10 µm i zamontować je na szkiełkach specjalnie przygotowanych do mrożonych sekcji tkankowych, które poprawiają adhezję tkanki podczas barwienia.
2. Sekcje poddać permeabilizacji przy użyciu 0,1% Triton X-10 w buforze fosforanowym (PBS) o pH 7,4 przez 5 min. Przemyć 2x w PBS i blokować przez 1 hr w temperaturze pokojowej w PBS z dodatkiem 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz 0,1% Tween 20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczny przedstawienie ogólnego protokołu. Po produkcji wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV), cząsteczki są wstrzykiwane do ciała szklistego lub do żyły prąciowej u znieczulonych dorosłych myszy. Wykonuje się obrazy dna ...