Przygotowanie kriosiekcji siatkówki myszy w celu oceny przepuszczalności siatkówki dla wirusa towarzyszącego adenowirusom

Streszczenie

Źródło: Vacca, O., et al. Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease. J. Vis. Exp. (2015)

W tym filmie zaprezentowano szczegółową procedurę przygotowywania kriosiekcji siatkówki myszy w celu wizualizacji przepuszczalności wirusa towarzyszącego adenowirusom przez uszkodzone bariery siatkówkowe.

Protokół

Wszystkie procedury obejmujące próbki zwierzęce zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez odpowiednią komisję etyczną ds. zwierząt. 

1. W przypadku kriosiekcji siatkówki (Rycina 1), przeprowadzić sekcję enukleowanych oczu w celu usunięcia soczewki i rogówki, a następnie utrwalić metodą imersyjną w 4% paraformaldehydzie przez 1 hr.
   1. Krioprotekcję wcześniej utrwalonych oczu przeprowadzić w 10% sacharozie przez 1 hr w temperaturze pokojowej, a następnie w 20% sacharozie przez kolejną godzinę w temperaturze pokojowej. Krioprotekcję w 30% roztworze sacharozy przeprowadzić przez noc w temperaturze 4 °C. Zamrozić i zatopić gałki oczne w żywicy do zatapiania, takiej jak Cryo-matrix. Wykonać kriosiekcje o grubości 10 µm i zamontować je na szkiełkach specjalnie przygotowanych do mrożonych sekcji tkankowych, które poprawiają adhezję tkanki podczas barwienia.
   2. Sekcje poddać permeabilizacji przy użyciu 0,1% Triton X-10 w buforze fosforanowym (PBS) o pH 7,4 przez 5 min. Przemyć 2x w PBS i blokować przez 1 hr w temperaturze pokojowej w PBS z dodatkiem 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz 0,1% Tween 20.

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczny przedstawienie ogólnego protokołu. Po produkcji wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV), cząsteczki są wstrzykiwane do ciała szklistego lub do żyły prąciowej u znieczulonych dorosłych myszy. Wykonuje się obrazy dna oka za pomocą kamery Micron III, aby monitorować ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). Wzorzec ekspresji GFP jest analizowany na kriosiekcjach siatkówki oraz preparatach siatkówki typu flatmount dzięki immunohistochemii i obrazowaniu konfokalnemu. Przenikanie AAV przez barierę krew-siatkówka (BRB) jest oceniane za pomocą analizy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w próbkach krwi pobranych od myszy po wtryśnięciu domięśniowym lub doszpikowym, w celu wykrycia obecności sekwencji GFP, która jest wskaźnikiem obecności cząsteczek AAV w krwiobiegu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Żywica do zatapiania Cryomatrix	Thermo Scientific	676906
Szkiełka adhezyjne Superfrost plus	Thermo Scientific	1014352
Stereomikroskop binokularny SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	Zoom 0,6 x 5 x diody LED z podstawą epi i dia / sekcja siatkówek
Nożyczki sprężynowe proste - 8,5 cm	Bionic France S.a.r.l	1503-08	Sekcja siatkówki