Dostarczanie genów za pomocą AAV w celu wizualizacji zaburzeń integralności błony siatkówki

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Vacca, O., et al. Using Adeno-associated Virus as a Tool to Study Retinal Barriers in Disease. J. Vis. Exp. (2015).

W niniejszym filmie zaprezentowano metodę dostarczania genów za pomocą AAV do siatkówki transgenicznej myszy, a następnie sekcję tkanek i barwienie w celu oceny integralności wewnętrznej błony ograniczającej.

Protokół

Wszystkie procedury z wykorzystaniem próbek zwierzęcych zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez odpowiednią komisję etyki badań na zwierzętach.

1. Immunohistochemia

W przypadku preparatów siatkówki w układzie płaskim (Rysunek 1), utrwalone usunięte gałki oczne w 4% paraformaldehydzie przez 15 min w celu ułatwienia sekcji.
1. W ciągu 15–30 min przeprowadzić sekcję oczu w celu usunięcia rogówki oraz soczewki. Oddzielić siatkówkę od nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE) i twardówki, wykonując cięcia wokół ora serrata oraz nerwu wzrokowego. Zanurzyć w 4% paraformaldehydzie na kolejne 30 min, aby utrwalić siatkówkę oraz białko fluorescencyjne w transdukowanych komórkach siatkówki (czas utrwalania nie może przekraczać 24 h). Płukać przez 5 min w sterylnym PBS o pH 7,4.
2. Zastąp fosforanowy bufor soli (PBS) buforem blokującym (PBS z 1% albuminą surowiczą bydlęcą (BSA), 2% normalną surowicą kozią lub osiołkową, 0,5% Triton X-10) i inkubuj w buforze blokującym przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub 4 °C przez noc.
Inkubować tkanki z przeciwciałami pierwszorzędowymi w buforze blokującym przez 4 godziny w temperaturze pokojowej lub w 4 °C przez noc. Przemyć 3x za pomocą PBS.
UWAGA: Użyte przeciwciała są następujące: anty-laminina (1/10) znakująca ILM (wewnętrzną błonę ograniczającą), anty-rodopsyna klon 4D2 (1/50) znakująca czopki, anty-syntetaza glutaminowa klon GS-6 (1/150) znakująca komórki Müllera, lektyna PNA (aglutynina fistaszkowa) (1/40) znakująca czopki.
Inkubować tkanki z przeciwciałami wtórnymi koniugowanymi z alexa fluorem w rozcieńczeniu 1:50 w buforze blokującym przez 1 h (przeciwycięcia) lub 2 h (preparaty typu flatmount) w temperaturze pokojowej, chroniąc próbki przed światłem. Przepłukać 3 razy PBS.
Należy wykonać nacięcia odciążające siatkówki, a następnie rozłożyć ją płasko na szkiełku przedmiotowym, tak aby strona z fotoreceptorami lub komórkami zwojowymi siatkówki (RGC) była skierowana do góry. Dodać wodne medium montażowe, nałożyć szkiełko nakrywkę i przechowywać w temperaturze 4 °C.
Wykonać mikroskopię konfokalną przy użyciu konfokalnego mikroskopu skanującego laserem. Obrazy należy pozyskiwać sekwencyjnie, linia po linii, aby zredukować interferencję (crosstalk) pobudzenia i emisji. Wielkość kroku należy określić zgodnie z twierdzeniem Nyquista–Shannona o próbkowaniu. Należy zastosować ustawienia ekspozycji minimalizujące liczbę przesyconych pikseli na końcowych obrazach. Obrazy 12-bitowe należy przetworzyć w programie FIJI, a następnie rzutować sekcje Z na pojedynczą płaszczyznę, stosując funkcję maksymalnej intensywności (maximum intensity) w opcji Z-project, i na koniec konwertować do 8-bitowego trybu kolorów RGB.

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczny przedstawienie ogólnego protokołu. Po produkcji AAV cząstki są wstrzykiwane do ciała szklistego lub do żyły prącia u znieczulonych dorosłych myszy. Wykonuje się obrazy dna oka przy użyciu kamery Micron III w celu monitorowania ekspresji GFP (zielonego białka fluorescencyjnego). Wzorzec ekspresji GFP jest analizowany na kriosiekcjach siatkówki oraz preparatach siatkówki typu flat-mount dzięki immunohistochemii i obrazowaniu konfokalnemu. Przejście AAV przez barierę krew-siatkówka (BRB) jest oceniane za pomocą analizy PCR próbek krwi pobranych od myszy po wstrzyknięciu do ciała szklistego lub do żyły prącia, w celu wykrycia obecności sekwencji GFP, która jest wskaźnikiem obecności cząstek AAV w krwiobiegu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Superfrost Plus Adhesion Slides	Thermo Scientific	1014352	Szkiełka
Anti-laminin	Sigma	L9393	Przeciwciało
Anti-rhodopsin clone 4D2	Millipore	MABN15	Przeciwciało
Anti-glutamine synthetase clone GS-6	Millipore	MAB302	Przeciwciało
Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein	Dako	34	Przeciwciało
PNA Lectin	Invitrogen	L32459	Sonda
Alexa fluor conjugated secondary antibodies	Invitrogen		Przeciwciało
Fluorsave reagent	Calbiochem	345789	Medium montażowe
Evans Blue dye	Sigma	E2129	Barwnik
Formamide spectrophotometric	Sigma	295876-2L
Fluorescein	Sigma	F2456	Barwnik
Micron III	Phoenix Research Labs		System mikroskopowy oparty na kolorowej kamerze 3-CCD, chwytaczu klatek i gotowym oprogramowaniu, umożliwiający obrazowanie siatkówek myszy.
Binocular magnifier SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	Zoom 0,6 x 5 x LED-y ze statywem epi i dia / Disekcja siatkówek
Spring scissors straight - 8,5 cm	Bionic France S.a.r.l	1503-08	Disekcja siatkówki