Produkcja i oczyszczanie rekombinowanych cząstek wirusa zapalenia wątroby typu B

Streszczenie

Źródło: Nishitsuji, H., et al. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (2017)

Niniejszy film prezentuje metodę produkcji i oczyszczania rekombinowanych cząstek wirusa zapalenia wątroby typu B, co pozwala na uzyskanie bezpiecznych, pozbawionych zdolności do replikacji preparatów wirusowych do badania wczesnych etapów infekcji oraz do zastosowań w wysokoprzepustowym przesiewaniu leków przeciwwirusowych.

Protokół

1. Produkcja rekombinowanego HBV (wirusa zapalenia wątroby typu B) kodującego białko reporterowe

1. Przygotowanie komórek HepG2
   1. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowej (pożywka DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) uzupełniona o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 U/ml penicyliny, 100 µg/ml streptomycyny oraz 100 U/ml niezasadniczych aminokwasów).
   2. Dzień przed transfekcją wysiać 4 x 10⁶ komórek HepG2 (ludzki rak hepatokomórkowy G2) do 10-cm szalki pokrytej kolagenem w 10 ml pożywki hodowlanej. Inkubować komórki HepG2 w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO₂ i zwiększoną wilgotnością.
      U....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik do testu lucyferazy Nano-Glo Luciferase Assay Regent	Promega	N1110
Mieszany roztwór penicyliny i streptomycyny	Nacalai tesque	09367-34
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Szkiełko 100 mm powlekane kolagenem	Iwaki	4020-010
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Glikol polietylenowy (PEG) 6000	Sigma-Aldrich	81255
Glikol polietylenowy (PEG) 8000	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai tesque	31319-45
Roztwór EDTA 0,5 mol/L	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
Filtr Millex-HP, 0,45 μm, polietersulfonowy	Merck Millipore	SLHP033RS
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Płytka 96-dołkowa powlekana kolagenem	Corning	NO3585
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-
pUC1.2HBV/NL	-	-