Produkcja i oczyszczanie rekombinowanych cząstek wirusa zapalenia wątroby typu B

Streszczenie

Źródło: Nishitsuji, H., et al. Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle. J. Vis. Exp. (2017)

Niniejszy film prezentuje metodę produkcji i oczyszczania rekombinowanych cząstek wirusa zapalenia wątroby typu B, co pozwala na uzyskanie bezpiecznych, pozbawionych zdolności do replikacji preparatów wirusowych do badania wczesnych etapów infekcji oraz do zastosowań w wysokoprzepustowym przesiewaniu leków przeciwwirusowych.

Protokół

1. Produkcja rekombinowanego HBV (wirusa zapalenia wątroby typu B) kodującego białko reporterowe

1. Przygotowanie komórek HepG2
   1. Przygotować pożywkę do hodowli komórkowej (pożywka DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) uzupełniona o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 U/ml penicyliny, 100 µg/ml streptomycyny oraz 100 U/ml niezasadniczych aminokwasów).
   2. Dzień przed transfekcją wysiać 4 x 10⁶ komórek HepG2 (ludzki rak hepatokomórkowy G2) do 10-cm szalki pokrytej kolagenem w 10 ml pożywki hodowlanej. Inkubować komórki HepG2 w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO₂ i zwiększoną wilgotnością.
      UWAGA: Gdy około 4 x 10⁶ komórek HepG2 zostanie wysianych do 10-cm szalki pokrytej kolagenem w 10 ml pożywki hodowlanej, następnego dnia osiągną one konfluencję na poziomie 70-90%.
2. Transfekcja
   1. Przeprowadzić transfekcję komórek HepG2 za pomocą 5 µg pUC1.2HBV delta epsilon15 (plazmidu replikacyjnego HBV z delecją w sekwencji epsilon) oraz 5 µg pUC1.2HBV/NL15, stosując odczynnik do transfekcji zgodnie z instrukcjami producenta.
   2. Następnego dnia usunąć pożywkę hodowlaną i dodać 10 ml świeżej pożywki.
   3. Tydzień po transfekcji przenieść pożywkę hodowlaną zawierającą rekombinowany HBV do probówki o pojemności 50 ml i przejść do kroku 1.3. Do szalki z transfekowanymi komórkami dodać 10 ml świeżej pożywki hodowlanej.
      UWAGA: Produkcja rekombinowanego HBV jest utrzymywana przez 4 tygodnie. Pożywkę hodowlaną zawierającą rekombinowany HBV można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
3. Oczyszczanie rekombinowanego HBV
   1. Usunąć zanieczyszczenia komórkowe z pożywki hodowlanej zawierającej rekombinowany HBV poprzez wirowanie (2,300 x g przez 5 min).
   2. Przepuścić nadsącz przez filtr membranowy 0,45 µm.
   3. Do pożywki hodowlanej zawierającej rekombinowany HBV dodać taką samą objętość 26% PEG/1,5 M NaCl (glikol polietylenowy 6000: 130 g, NaCl (chlorek sodu): 49 g, 1 ml 0,5 M EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) pH 8,0 oraz 5 ml 1 M HEPES (kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N'-2-etanosulfonowy) pH 7,6 w 500 ml) i delikatnie wymieszać. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
   4. Wirować przy 2,300 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C.
   5. Odlać nadsącz, a osad rozpuścić w 0,5 ml buforu TNE (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
   6. Usunąć zanieczyszczenia poprzez wirowanie przy 2,300 x g przez 5 min.
   7. Nanieść 0,5 ml TNE zawierającego rekombinowany HBV na 0,8 ml 20% sacharozy w TNE.
   8. Wirować przy 100,000 × g przez 3 h w temperaturze 15 °C.
   9. Odlać jak największą ilość nadsączu i zachować osad. Resuspendować go w 1 ml DMEM bez surowicy na każde 40 ml początkowej pożywki hodowlanej.
   10. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
   11. Przefiltrować przez filtr 0,45 µm. Przygotować alikwoty o objętości 0,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C.
       UWAGA: W przypadku stwierdzenia zanieczyszczenia pierwotnej próbki wirusa białkiem reporterowym, oczyścić wirusa metodą ultrawirowania w gradiencie gęstości sacharozy 5-30% w TNE przy 100,000 x g przez 2 h lub wirowaniem w gradiencie gęstości CsCl (chlorku cezu) od 1,1-1,6 g/ml przy 150,000 x g przez 50 h.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik do testu lucyferazy Nano-Glo Luciferase Assay Regent	Promega	N1110
Mieszany roztwór penicyliny i streptomycyny	Nacalai tesque	09367-34
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Szkiełko 100 mm powlekane kolagenem	Iwaki	4020-010
Odczynnik do transfekcji Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Glikol polietylenowy (PEG) 6000	Sigma-Aldrich	81255
Glikol polietylenowy (PEG) 8000	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai tesque	31319-45
Roztwór EDTA 0,5 mol/L	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
Filtr Millex-HP, 0,45 μm, polietersulfonowy	Merck Millipore	SLHP033RS
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Płytka 96-dołkowa powlekana kolagenem	Corning	NO3585
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-
pUC1.2HBV/NL	-	-