Wyciszanie genów w larwach komarów za pomocą rekombinowanego densovirusa

Streszczenie

Źródło: Liu, P., et al. Use of a Recombinant Mosquito Densovirus As a Gene Delivery Vector for the Functional Analysis of Genes in Mosquito Larvae. J. Vis. Exp. (2017)

W niniejszym filmie zaprezentowano zastosowanie rekombinowanych densowirusów komarów kodujących mikroRNA w celu wyciszenia specyficznych genów w larwach komarów. Zainfekowane larwy we wczesnych stadiach rozwojowych produkują funkcjonalne mikroRNA, które tłumią ekspresję genu docelowego na potrzeby dalszych badań.

Protokół

1. Transdukcja komarów

1. Przepłucz 100 larw I stadium Aedes albopictus larwy trzy razy przy użyciu wody dejonizowanej, a następnie przenieść larwy do zlewki zawierającej 95 ml wody dejonizowanej. Dodać 5 ml rekombinowanego Aedes aegypti stany zapasowe densowirusa (rAaeDV) (stężenie końcowe 1,00 x 10¹⁰ kopii/ml).
2. Inkubować przez 24 h w temperaturze 28 °Cprzemyć larwy trzykrotnie wodą dejonizowaną, a następnie przenieść je z powrotem na płytki i regularnie karmić.
3. Poziom ekspresji genu docelowego w larwach należy monitorować za pomocą qPCR lub Western blot.
   UWAGA: Metodę detekcji sygnału fluorescencji można wykorzystać do bardziej precyzyjnej izolacji zainfekowanych larw. Na przykład, w celu wykrycia sygnałów fluorescencyjnych u larw zainfekowanych rekombinowanym wirusem wykazującym ekspresję białka DsRed, larwy można umieścić na szkiełku zagłębnikowym i obserwować pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym co 8 h do 2 dni po infekcji. Po wykryciu fluorescencyjnych larw należy je przenieść do oddzielnych plastikowych kubeczków testowych, aby umożliwić dalszą ciągłą obserwację. Metodą tą można zidentyfikować larwy z zainfekowanymi wieloma tkankami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wirówka	Thermo Scientific	75004260
System wirówkowy	Beckman Coulter	363118
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)	Beijing Tiangen Biotech	FP205