Wizualizacja poddanych obróbce termicznej kapsydów wirusowych przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Streszczenie

Źródło: Moore, M. D., et al. Alternative In Vitro Methods for the Determination of Viral Capsid Structural Integrity. J. Vis. Exp.(2017).

Ten film demonstruje, w jaki sposób oczyszczone kapsydy wirusowe są poddawane obróbce termicznej, przygotowywane i obrazowane przy użyciu transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w celu ujawnienia zmian strukturalnych i uszkodzeń wywołanych ciepłem.

Protokół

1. Przygotowanie próbek do TEM
   1. Należy przygotować siatki z filmu węglowego (nikle) przeznaczone do TEM.
      UWAGA: Należy skonsultować z personelem jednostki centralnej (core facility) kwestię zalecanych odczynników oraz zasad ich obchodzenia się podczas pracy z mikroskopem danej jednostki. Siatki należy przechowywać w pudełku z osuszaczem lub w komorze próżniowej, aby zminimalizować ekspozycję na wilgoć.
   2. Należy podrzeć fragmenty papieru filtracyjnego o wymiarach około 5 cm x 5 cm. Należy przygotować szklane szalki Petriego oraz odpowiednie samoczynnie zamykane pincety odwrócone, przeznaczone do mikroskopii.
   3. Należy wyciąć fragment folii parafinowej o wymiarach około 2,5 cm x 5 cm i położyć go na blacie roboczym.
   4. Obróbka termiczna kapsydów norowirusa GII.4 Sydney
      1. Należy uzyskać oczyszczone główne białko kapsydu (VP1) ludzkiego norowirusa szczepu GII.4 Sydney (numer akcesyjny: JX459908) zmontowane w kapsydy. 
         UWAGA: Kapsydy wykorzystane w badaniu zostały udostępnione przez R. Atmara (Baylor College of Medicine, Houston, TX).
      2. Kapsydy należy rozcieńczyć w 10 mM kwasie 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym (HEPES) (pH 7,4) do maksymalnej objętości 15 µL w oddzielnych zatykanych probówkach do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Należy upewnić się, że probówka zawiera co najmniej 600 ng kapsydu. Należy zapewnić obecność 600 ng kapsydu dla każdej kombinacji obróbki i liganda.
      3. Termocykler należy wstępnie podgrzać do pożądanej temperatury obróbki termicznej. 
         UWAGA: W niniejszym protokole wybrano obróbkę w temperaturze 68 °C przez różne odstępy czasu (0 – 25 min).
      4. Dodatkowy termocykler należy schłodzić do 4 °C w celu natychmiastniego chłodzenia. Probówki z roztworem kapsydów należy umieścić w termocyklerze na wymagany czas. Po podgrzewaniu należy natychmiast przenieść je do schłodzonego termocyklera (4 °C) na 5 min.
      5. Próbówki należy krótko odwirować w wirówce, aby wszystkie kropelki opadły na dno.
      6. Całą kroplę (~15 µL) obrobionego roztworu kapsydów należy nanieść pipetą na folię parafinową.
   5. Krawędź siatki należy chwycić pincetą, pozwalając jej zamknąć się na brzegu w celu przytrzymania siatki, a następnie położyć siatkę stroną węglową do dołu na kropli obrobionego roztworu. Pozostawić na 10 min, aby kapsydy przyłączyły się do siatki.
      1. W zależności od czystości preparatu kapsydów, jeśli jest to konieczne, należy dodać przemycia roztworem 10 mM HEPES w formie kropli 10-15 µL umieszczonych w linii za kroplą obrobionych kapsydów.
      2. Po 10 min należy podnieść siatkę wraz z kroplą. Siatkę należy przyłożyć niemal prostopadle do kawałka papieru filtracyjnego, aby odprowadzić kroplę. Następnie należy podnieść siatką kroplę 10-15 µL buforu HEPES, przytrzymać przez 30 s, a następnie odprowadzić roztwór kolejnym kawałkiem papieru filtracyjnego w celu przemycia.
   6. Na wolnym obszarze folii parafinowej należy nanieść kroplę 15 µL 2% roztworu octanu uranylowego.
      1. Siatkę należy zanurzyć w kropli octanu uranylowego i przytrzymać przez 45 s. Następnie należy odprowadzić octan uranylowy, upewniając się, że usunięto większość roztworu. Siatkę należy położyć stroną węglową do góry na kawałku papieru filtracyjnego, dbając o to, aby siatka nie „przykleiła się” do wilgoci na pincecie. Papier filtracyjny z siatką należy umieścić w otwartej szklanej szalce Petriego.
         UWAGA: Nie należy używać plastikowych szalek Petriego, ponieważ siatki będą przyciągane do nich elektrostatycznie i przykleją się do szalki.
   7. Procedurę należy powtórzyć dla wszystkich wariantów obróbki. Połówki szalek Petriego z siatkami należy umieścić w desykatorze na noc w celu wysuszenia przed obserwacją w TEM.
   8. W kwestii obserwacji przygotowanych siatek należy skonsultować się z pracownią mikroskopii w odpowiedniej instytucji. Niektóre jednostki umożliwiają przeszkolenie użytkownika w obsłudze posiadanych instrumentów. Szczegółowe informacje dotyczące konfiguracji i obserwacji przy użyciu konkretnego mikroskopu wykraczają poza zakres niniejszego artykułu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przygotowanie próbek do transmisyjnej mikroskopii elektronowej
Siatki niklowe do mikroskopii elektronowej z warstwą wspierającą z węgla	Ladd Research	10880-100
Samozamykająca się pęseta odwrócona do mikroskopii elektronowej	Ted Pella	5372-NM
Filtr kwalitatywny	Sigma-Aldrich (Whatman)	WHA1002055
Szklane szalki Petriego	Sigma-Aldrich	BR455743
Roztwór stokowy HEPES 100 mM (pH 7,2)	N/A	Nie dotyczy
2% octan uranylu	N/A	N/D