Artykuł metodologiczny

Rejestrowane obrazowanie biomedyczne nanomateriałów w monitorowaniu diagnostyki i terapii

12.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/2459

⸱

9 grudnia 2010

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiology, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Pharmacology and Experimental Neuroscience, University of Nebraska Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Metody obrazowania biologicznego stosowane do oceny biodystrybucji komórkowej nanocząsteczek znajdują zastosowanie w monitorowaniu terapeutycznym i diagnostycznym związków sformułowanych w nanostruktury. Metody opisane w niniejszym opracowaniu są czułe i swoiste w ocenie za pomocą korejestracji histologicznej. Przedstawione metodologie zapewniają ścieżkę translacyjną od zastosowań na modelach gryzoni do zastosowań u ludzi.

Streszczenie

Nanoleki mogą być transportowane przez krążące we krwi monocyty i makrofagi do układu siateczkowo-śródbłonkowe (RES; śledziona, wątroba, węzły chłonne) oraz do organów docelowych. Do tych ostatnich należą płuca, RES i mózg, które są zaangażowane podczas infekcji wirusemGetService immunodeficytu ludzkiego typu 1 (HIV-1). Przenikanie makrofagów do tkanek jest szczególnie zauważalne w obszarach aktywnej replikacji HIV-1 oraz w miejscach stanu zapalnego. Aby ocenić potencjał makrofagów jako nanonośników, do myszy z encefalitem wywołanym przez HIV-1 wstrzykiwano drogą parenterystyczną nanocząstki superparamagnetycznego tlenku żelaza i/lub cząstki obciążone lekiem, powleczone surfaktantami. Przeprowadzono to w celu ilościowej oceny biodystrybucji cząstek i leku. Wyniki obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI) zostały zweryfikowane poprzez korejestrację histologiczną i zaawansowane przetwarzanie obrazu. Chorobę organów docelowych, objawiającą się zmianami w histologii mózgu, oceniono za pomocą MRI. Wykazanie intensywnej migracji nanoformułacji do obszarów ogniskowego zapalenia mózgu stanowi „dowód koncepcji” (proof of concept) dla zastosowania zaawansowanych technik bioobrazowania w monitorowaniu migracji makrofagów. Co istotne, aberracje histopatologiczne w mózgu korelują z parametrami bioobrazowania, co potwierdza użyteczność MRI w badaniach nad dystrybucją komórek w przebiegu chorób. Zakładamy, że stosowanie takich metod może dostarczyć w czasie rzeczywistym wskaźnika obciążenia chorobą oraz skuteczności terapeutycznej z potencjałem translacyjnym na ludzi.

Protokół

1. Wstęp

Selektywne dostarczanie leków oraz terapeutycznych makrocząsteczek (peptydów, białek i kwasów nukleinowych) do komórkowych i tkankowych ognisk aktywnej choroby oraz toczących się infekcji mikrobiologicznych poprawi odpowiedź farmakologiczną w trakcie przebiegu choroby1-3. Jednym z takich szczególnych miejsc komórkowych jest makrofag, który jest wysoce mobilny, uczestniczy w odpowiedzi immunologicznej i stanowi stały, główny cel dla ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV).4 Co istotne, zapalenie angażujące makrofagi leży u podstaw szerokiej gamy zaburzeń, w tym chorób degeneracyjnych, zapalnych, zakaźnych i nowotworowych; natomiast mobilność tych komórek do ognisk chorobowych warunkuje progresję uszkodzeń tkanek5-9. Znaczną uwagę poświęcono ostatnio potencjałowi translacyjnemu wykorzystania makrofagów krążących we krwi jako nośników leków, makrocząsteczek i sygnałów. Jednak istotną przeszkodą w realizacji potencjału terapeutycznego jest bariera krew-mózg (BBB) oraz inne bariery tkankowe, które są nieprzepuszczalne dla wielu makrocząsteczek i białek. Bariery te dopuszczają jednak przejście komórek. Zakłada się zatem, że w naturalnym przebiegu choroby makrofagi obwodowe, które omijają bariery, mogą przenosić sformułowane leki, markery i peptydy do miejsc infekcji lub zapalenia. Niemniej jednak technologie te pozostają w fazie rozwoju. Nasze prace wskazują, że dostarczanie zapośredniczone przez komórki może zostać opracowane do zastosowań diagnostycznych i terapeutycznych, a takie zastosowania znajdują potwierdzenie w laboratoryjnych i zwierzęcych modelach ludzkich chorób10-12.

2. Przygotowanie nanomateriałów

Przygotowanie nanomateriałów do badań nad dostarczaniem leków i biodystrybucją jest tematem równoległego artykułu w tym numerze (referencja do równoległego artykułu). Wszystkie procedury wytwarzania krystalicznych nanocząsteczek są przeprowadzane w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Wszystkie powierzchnie są dezynfekowane przed użyciem 70% alkoholem. Dotyczy to powierzchni roboczej, zewnętrznej strony rękawiczek oraz wszelkich rozlanych substancji. Wszystkie takie miejsca są niezwłocznie przecierane chusteczkami nasączonymi roztworem 70% alkoholu. Rękawiczki są utylizowane po użyciu i nie powinny być noszone podczas wchodzenia do jakichkolwiek innych obszarów laboratorium. Substancje pomocnicze, lek oraz sterylna woda z dowolnymi lub wszystkimi odczynnikami niezbędnymi do wytwarzania cząsteczek obciążonych lekiem są wnoszone do obszarów roboczych tylko wtedy, gdy są potrzebne do przeprowadzenia procedur. Stosuje się wyłącznie sterylnie zapakowane pipety, które po użyciu są wyrzucane do pojemnika na odpady biologiczne. Aparatura do mokrego mielenia jest dezynfekowana alkoholem przed i po użyciu. Obszar roboczy jest czyszczony 70% alkoholem bezpośrednio przed i po pracy. Roztwór nanocząsteczek jest badany pod kątem obecności pirogenów zgodnie z wytycznymi FDA, aby ocenić brak endotoksyn bakteryjnych w roztworach cząsteczek leku stosowanych u zwierząt. W skrócie,

  1. Kandydackie nanoformulacje do zastosowań in-vivo są replikowane poprzez zastąpienie rdzenia leku lub kropelki cząsteczką o identycznym rozmiarze lub zmielonym fragmentem superparamagnetycznego tlenku żelaza (SPIO) przed powleczeniem odpowiednim surfaktantem.
  2. Następnie przeprowadza się pomiary rozmiaru, ładunku, kształtu i cytotoksyczności, aby ustalić, czy modelowy system SPIO posiada takie same właściwości jak kandydacka nanoformulacja leku.
  3. Na koniec wykonuje się testy obciążenia komórek poprzez inkubację z kandydacką modelową nanoformulacją SPIO w celu określenia relaksywności wewnątrz komórek przy użyciu fantomów składających się z oznakowanych komórek zawieszonych w żelu agarowym. Fantomy są przygotowywane w trzech powtórzeniach oraz w serii stężeń, aby ilościowo określić relaksywność wynikającą z wychwytu SPIO przez komórki. Pozwala to na uzyskanie wskaźnika czułości i określenie, czy nanoformulacje mogą wpływać na stan utlenienia, a tym samym na widoczność SPIO w obrazowaniu rezonansem magnetycznym (MRI).

3. Metody i procedury: Przygotowanie zwierząt

  1. Iniekcje/cewniki. W zależności od analizowanego przedziału czasowego, iniekcje mogą wymagać zastosowania cewnika w celu podania substancji zwierzęciu podczas badania MRI. Cewniki przygotowuje się przy użyciu niemagnetycznej igły oraz przedłużenia w postaci rurki o minimalnej średnicy, aby zminimalizować przestrzeń martwą w linii iniekcyjnej. Cewnik należy uprzednio wypełnić albo roztworem zawierającym wstrzykiwany nanomateriał, albo solą fizjologiczną, w zależności od objętości przestrzeni martwej i całkowitej dopuszczalnej objętości iniekcji. Jeśli jest to możliwe, po iniekcji można przeprowadzić przepłukanie solą fizjologiczną. Jeżeli precyzyjny pomiar czasu w fazie ostrej nie jest krytyczny, można wykonać skan wstępny, a iniekcję przeprowadzić poza obszarem działania magnesu w określonym czasie przed skanami kontrolnymi służącymi do pomiaru biodystrybucji. W przypadku iniekcji dożylnych (I.V.) cewniki są zazwyczaj wprowadzane do żyły ogonowej.
  2. Znieczulenie i monitorowanie. Przed rozpoczęciem skanowania zwierzę umieszcza się w komorze w celu indukcji znieczulenia. Komorę tę napełnia się wcześniej mieszaniną 1,5% izofluranu w 70% tlenku azotu i 30% tlenu, aby przyspieszyć wystąpienie znieczulenia u zwierzęcia i zminimalizować czas potrzebny do zapewnienia, że zwierzę nie obudzi się po wyjęciu z komory. Gdy zwierzę zostanie w pełni znieczulone, wyjmuje się je z komory i umieszcza w uchwycie stereotaktycznym wyposażonym w system do monitorowania częstości oddechów i temperatury zwierzęcia, przy jednoczesnym kontynuowaniu podawania izofluranu podczas przygotowania i skanowania.
  3. Uchwyty dla zwierząt i kwestie regulacji: Przygotowanie obejmuje zastosowanie środka nawilżającego do oczu w celu ochrony przed owrzodzeniami rogówki. Zwierzę jest lekko owinięte gazą, która zostaje przymocowana taśmą, aby zminimalizować utratę ciepła podczas skanowania i zapewnić dodatni nacisk na monitor oddechowy. Uchwyty dla zwierząt są wyposażone w regulowane listwy zębowe, umożliwiające pionowe i poziome ustawienie głowy. Jest to szczególnie istotne w przypadku wysokopolowego MRI, ponieważ nachylenie głowy w kierunku ogonowo-nosowym spowoduje dodatkowe trudności z niejednorodnością pola magnetycznego ze względu na podatność magnetyczną. Niejednorodność pola magnetycznego jest szkodliwa dla wysokiej jakości T2Badanie MRI, jak również 1spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego protonów (H1H MRS) oraz obrazowania tensora dyfuzji w rezonansie magnetycznym (DTI). Oprócz właściwego ustawienia kąta głowy w kierunku ogonowo-rostralnym, należy w miarę możliwości unikać rotacji głowy. Możliwość obrotu uchwytu zwierzęcia w magnesie pozwoli na skompensowanie niewielkich rotacji, które mogą występować u poszczególnych osobników. Można je dodatkowo zminimalizować poprzez staranne ułożenie głowy i zwrócenie uwagi na kąt nachylenia przed wprowadzeniem zwierzęcia do systemu MRI.
  4. Kalibracja i shimming: Po umieszczeniu zwierzęcia w uchwycie i prawidłowym ułożeniu cewki powierzchniowej na głowie, początkowa pozycja zwierzęcia jest określana za pomocą jednowymiarowego odczytu w czasie rzeczywistym w kierunku gudało-rostralnym. Sygnał jest ograniczony do obszaru wokół zastosowanej cewki odbiorczej, co ogranicza konieczność interpretacji obserwowanych przebiegów falowych. Po określeniu pozycji początkowej wykonuje się obraz lokalizacyjny w trzech płaszczyznach, aby ustalić dokładne położenie zwierzęcia w skanerze i umożliwić przesunięcie go do precyzyjnej lokalizacji wymaganej dla interesujących nas skanów. Następnie przeprowadza się regulację jednorodności pola magnetycznego, czyli tzw. „shimming” magnesu. Odbywa się to poprzez mapowanie rozkładu pola i obliczenie precyzyjnie określonej korekty przestrzennej na podstawie zmierzonych odpowiedzi serii elektromagnesów lub „cewek shimmingowych” w systemie, zaprojektowanych do regulacji jednorodności pola. Shimming jest realizowany przy użyciu sekwencji wielogradientowego echa oraz oprogramowania do mapowania opracowanego przez dr. Hetheringtona.13Obszary homogeniczności są dopasowywane do obszaru badanego przez każdą z poszczególnych metod obrazowania. Po zakończeniu procesu shimowania można przeprowadzić wymagane skanowanie zwierzęcia.

4. Pozyskiwanie danych

  1. MRI o wysokiej rozdzielczości z obciążeniem T2*. Biodystrybucję nanocząsteczek zawierających SPIO można określić poprzez wykrywanie obszarów utraty sygnału w wysokorozdzielczym 3D MRI z obciążeniem T2*. Obszar mózgu jest wyznaczany na podstawie skanów lokalizacyjnych i planowany na skanach lokalizacyjnych lub dodatkowych skanach w razie potrzeby. Następnie wykonuje się skan MRI z obciążeniem T2* o izotropowej rozdzielczości 150 mikronów. Wysokorozdzielczy 3D skan MRI głowy myszy z zastosowaniem gradientowego echa (gradient recalled echo) wykonuje się przy użyciu cewki wolumetrycznej typu birdcage o średnicy 25 mm z następującymi parametrami akwizycji: czas echa = 5 ms, czas repetycji = 50 ms, 30% echa, kąt przechyłu = 35 stopni, liczba uśrednień = 2, pole widzenia = 20 x 20 x 20 mm przy rozdzielczości 128 x 128 x 128 (wielkość woksela = 150 x 150 x 150 μm3), całkowity czas akwizycji = 30 min.
  2. Obrazowanie tensora dyfuzji (DTI): Obrazy tensora dyfuzji są ilościowymi pomiarami kierunku i wielkości dyfuzji wody wewnątrz komórek tkanki. W konsekwencji faza sygnału jest niezwykle podatna na ruch, ponieważ skany są uwrażliwione lub „obciążone” na mikroskopijne ruchy wody. Z tego powodu pożądane są akwizycje jednobłyskowe (single shot), aby zapobiec przesunięciom fazowym między akwizycjami, które mogłyby spowodować rozmycie sygnału; wymagane jest również bramkowanie oddechowe, aby zapobiec znacznym ruchom podczas akwizycji sygnału. Dlatego zastosowano sekwencję MR obrazowania planarnego echa (EPI) z obciążeniem dyfuzyjnym i impulsem spin-echo z bramkowaniem oddechowym. Ponownie, bardzo ważne jest shimming obszaru skanowania, ponieważ efekty poza rezonansem podczas ewolucji sygnału powodują błędną rejestrację częstotliwości sygnału, a tym samym jego pozycji w płaszczyźnie obrazu. Parametry akwizycji EPI obejmowały 14 warstw, szerokość pasma 200 KHz, akwizycję w płaszczyźnie 96 x 96 z dopełnieniem zerami do 256 x 256 oraz grubość warstwy 0,5 mm. Zastosowany schemat kodowania dyfuzji był zbalansowanym, rotacyjnie niezmiennym i naprzemiennym polarnościowo schematem ikosaedralnym (12 kierunków) 14,15. Schemat kodowania został zaprojektowany w celu zmniejszenia sprzężeń gradientu dyfuzji tła 16. Współczynnik obciążenia dyfuzyjnego b = 800 s mm-2, δ=4 ms, Δ=15 ms, Gdmax= 40 G/cm, czas narastania 200 μs, 7 uśrednień dla akwizycji b=0, 3 uśrednienia dla każdego kierunku kodowania b=800, przy całkowitym czasie akwizycji 20-40 min, w zależności od częstości oddechów.
  3. Lokalna spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego 1H (1H MRS): Dane 1H MRS można uzyskać z obszarów mózgu wyznaczonych na obrazach nabytych podczas tej samej sesji obrazowania. Lokalizacje anatomiczne są wyszukiwane na obrazach w celu wyznaczenia obszaru zainteresowania dla akwizycji widm. Po zidentyfikowaniu obszaru wykonuje się shimming w regionie odpowiadającym objętości akwizycji, co jest sprawdzane za pomocą lokalnego widma wody. Następnie optymalizuje się moc impulsów tłumienia wody, mierzy częstotliwość wody, aby zapewnić sygnał wody w rezonansie, i wykonuje krótkie widmo testowe w celu kontroli jakości. Jeśli widma mają niewystarczającą jakość, sprawdzane są ustawienia systemu, w tym moc częstotliwości radiowej (RF) i ustawienia shimowania. Ostatecznie, jeśli jakość nadal jest niewystarczająca, wykonuje się drugi lokalizator w trzech płaszczyznach, aby upewnić się, że zwierzę nie przesunęło się względem wstępnych skanów. Według naszego doświadczenia zapewnia to bardzo wysoki stopień powtarzalności i dokładności akwizycji spektroskopowych. Wreszcie, widma są nabywane w krótkich blokach z resetowaniem częstotliwości systemu między akwizycjami, aby wyeliminować efekty dryftu pola magnetycznego i zapewnić powtarzalność oraz jakość końcowych skanów. Na koniec akwizycji, widmo wody z pojedynczym impulsem przy zdefiniowanym wzmocnieniu przedwzmacniacza służy jako ilościowy punkt odniesienia amplitudy sygnału.
  4. Histologia i obrazowanie powierzchni bloku: Po ostatniej sesji skanowania MRI w serii czasowej eksperymentów, mysz jest perfumowana, mózg jest usuwany i zatapiany w bloku OCT, który został przyciemniony za pomocą kropli tuszu indyjskiego. Blok jest umieszczany w kriotomie w celu cięcia i analizy histologicznej. Obrazy powierzchni bloku są nabywane za pomocą cyfrowego aparatu (Canon EOS Digital Rebel 300D z obiektywem Canon Ultrasonic EFS 60mm f/2.8 Macro USM) zamontowanego z przodu kriotomu za pomocą niestandardowego uchwytu i wyzwalanego zdalnym przełącznikiem. Cyfrowe obrazy są nabywane co 50 mikrometrów przez całą objętość mózgu. Przekroje są numerowane, aby umożliwić rejestrację w obrębie objętości po obróbce histologicznej i barwieniu. Poszczególne przekroje powierzchni bloku zostały wyrównane w celu rekonstrukcji objętości 3D, wykorzystując kontury bloku do skorygowania drgań głowicy kriotomu. Objętość mózgu jest następnie automatycznie segmentowana za pomocą algorytmu wzrostu regionu opartego na ziarnach (seed based region growing) w pakiecie oprogramowania Analyze (AnalyzeDirect, Lexena, KS).

5. Analizy danych

  1. Detekcja SPIO za pomocą MRI: SPIO powodują utratę sygnału w obrazowaniu MRI ważonym T2*; w związku z tym ubytek sygnału MRI jest czułym, choć nieswoistym markerem obecności SPIO w tkance. Czułość zależy od rozdzielczości przestrzennej skanu MRI oraz rozmiaru cząsteczki SPIO; pojedyncza cząsteczka o rozmiarze jednego mikrona jest wykrywana przy izotropowej rozdzielczości 100 mikronów. W niniejszych pracach zastosowano izotropową rozdzielczość 150 mikronów oraz cząsteczki SPIO o rozmiarze 200 nanometrów. Aby zapewnić zarówno czułość, jak i swoistość w wykrywaniu SPIO w mózgu, myszy były skanowane przed wstrzyknięciem komórek znakowanych SPIO, co pozwoliło na wykorzystanie obrazów różnicowych do pozytywnej identyfikacji komórek w mózgu w późniejszych punktach czasowych. Skanowanie MRI 3D poddano segmentacji przy użyciu metody ograniczonego zbioru poziomów (constrained level set) opracowanej w naszym laboratorium, jak opisano wcześniej17. Segmentowane objętości mózgu zostały następnie zarejestrowane wspólnie, znormalizowano ich intensywność sygnału, a następnie odjęto od siebie objętości w celu wykrycia obszarów w obrębie mózgu z utratą sygnału (obecność SPIO), wykluczając obszary przy krawędziach, aby wyeliminować fałszywie dodatnie sygnały wynikające z błędów rejestracji na poziomie subpikseli.
  2. Wspólna rejestracja histologii i MRI: Wspólna rejestracja obrazowania histologicznego i MRI została przeprowadzona z wykorzystaniem obrazu powierzchni bloku jako wspólnego punktu odniesienia. Podejście to sprowadza złożony problem korygowania asymetrycznego kurczenia się skrawków tkanki podczas przygotowania i barwienia do problemu dwuwymiarowego, zgodnie z opisem w naszych poprzednich pracach18,19. W tym przypadku detekcja makrofagów zawierających SPIO w mózgu za pomocą MRI i histologii wykazała doskonałą korelację przestrzenną, przy spodziewanym przeszacowaniu objętości wynikającym z utraty sygnału MRI oraz większej czułości histologii w wykrywaniu niewielkiej liczby komórek12. Precyzyjna ko-lokalizacja tych dwóch sygnałów stanowi miarę dokładności wspólnej rejestracji i przekształcenia (warping) danych histologicznych z powrotem do pierwotnych kształtów skrawków.
  3. Analizy obszarów zainteresowania (ROI) w DTI: Skanowanie DTI jest zazwyczaj analizowane poprzez wybór anatomicznego ROI w celu określenia średnich właściwości dyfuzyjnych tkanki w konkretnej podstrukturze anatomicznej.
    Analizy danych ważonych dyfuzją są wykonywane przy użyciu dedykowanych programów napisanych w języku IDL (Interactive Data Language, ITT Visual Information Solutions, Boulder, CO), jak opisano wcześniej15,20. Analizy te pozwalają na generowanie map dyfuzyjności tensora (λ1, λ2, λ3), średniej dyfuzyjności (Dav), gdzie: Dav = (λ1+λ2+λ3)/3 oraz anizotropii frakcyjnej (FA), gdzie:
    Formuła analizy statystycznej obliczeń FH; równanie dla metodologii badawczej.
    Poprzeczne (λ⊥=(λ2+λ3)/2) i podłużne (λll=λ1) komponenty tensora dyfuzji uzyskano zgodnie z opisem w innym opracowaniu21. Po sporządzeniu map, obszary ROI są wyznaczane na obrazach MRI ważonych T2 z nałożonymi mapami kierunkowości λ1 zakodowanymi kolorystycznie. Przykłady obszarów wybranych do analizy w mysim modelu HIV przedstawiono na Rysunku 1.
  4. Analiza spektroskopowa: Ilościowe oznaczenie związków metabolicznych przyczyniających się do pików w spektroskopii 1H MRS mózgu jest ustalane przy użyciu jednej z wielu metod dopasowania krzywych. Opracowano różnorodne techniki dopasowywania krzywych. W naszym laboratorium stosujemy metodę dopasowania w dziedzinie czasu (QUEST)22 w pakiecie do przetwarzania sygnałów jMRUI23, która stanowi liniową kombinację poszczególnych widm metabolitów przyczyniających się do widma końcowego. Wykorzystujemy zestaw bazowy 22 poszczególnych metabolitów jako potencjalne czynniki wpływające na wynik. Widma bazowe są symulowane i weryfikowane przy użyciu widm roztworów poszczególnych metabolitów. Przykład wyniku dopasowania krzywej z pojedynczego widma przedstawiono na Rysunku 2.

6. Reprezentatywne wyniki

Przykłady DTI oraz 1HMRS przedstawiono na rysunkach 1 i 2. Dodatkowe przykłady wyników 1H MRS24-26 oraz DTI27 można znaleźć w naszych poprzednich publikacjach. Przykład obrazowania MRI ważonego T2* przed iniekcją z nałożoną na żółto lokalizacją znakowanych komórek przedstawiono na rysunku 3. Myszy wżylowo w ogonie wstrzyknięto znakowane makrofagi pochodzące z monocytów. Pięć dni później wykonano obrazowanie MRI ważone T2*, a następnie przetworzono je zgodnie z powyższym opisem. Myszy przygotowano poprzez wstrzyknięcie do mózgu ludzkich makrofagów zakażonych wirusem HIV, co widoczne jest jako linia wykrytych mysich makrofagów pochodzących z monocytów. Dalsze przykłady wykrywania znakowanych komórek oraz koregistracji z histologią można znaleźć w naszych poprzednich publikacjach10,12.

Schemat obrazowania mózgu z oznakowanymi obszarami: kora, ciało modzelowate, hipokamp, móżdżek.
Rycina 1. Przedstawienie obszarów analizowanych pod kątem parametrów DTI.

Analiza dopasowania widma; wykres i tabela danych; eksperyment spektroskopowy; wyniki w dziedzinie częstotliwości.
Rysunek 2. Dopasowanie spektroskopowe z wykorzystaniem QUEST w pakiecie przetwarzania sygnałów jMRUI.

Analiza aktywności mózgu za pomocą MRI; sekwencja obrazowania pokazująca wzorce aktywacji; badanie naukowe.
Rysunek 3. Detekcja komórek znakowanych SPIO migrujących z krwi obwodowej do obszaru mózgu z ogniskowym zapaleniem mózgu. Pozycje komórek (żółte) nałożone na reprezentatywne przekroje z akwizycji MRI ważonej T2*, zgodnie z opisem w tekście.

Dyskusja

Dokładna rejestracja histologii z wynikami obrazowania in-vivo jest krytycznym krokiem w opracowywaniu biomarkerów obrazowych służących do wykrywania i określania stadium chorób neuronalnych. Niektóre parametry obrazowania prawdopodobnie korelują z grubymi zmianami morfologicznymi, w tym ze zmianami magnetycznych właściwości relaksacyjnych tkanki, wykorzystywanych do wykrywania chorób istoty białej i nowotworów. Inne, bardziej subtelne metody, takie jak DTI, mogą wykrywać wczesne zmiany komórkowe, które mogą być niewidoczne w badaniu histologicznym, ponieważ zmiany histopatologiczne wywołane chorobą pojawiają się dopiero w późniejszych stadiach. Jeszcze inne wskaźniki, takie jak markery spektroskopowe, mogą być sygnałami wczesnych i odwracalnych zmian, które wyprzedzają nawet najsubtelniejsze przekształcenia komórkowe.

Biodystrybucję można określić nieinwazyjnie, stosując szereg różnych metod. Głównymi metodami nieinwazyjnymi są pozytonowa tomografia emisyjna (PET), jedno- i wielofotonowa tomografia emisyjna (SPECT), obrazowanie optyczne oraz MRI. Metody obrazowania oparte na medycynie nuklearnej (PET i SPECT) były przez lata wykorzystywane w wielu badaniach biodystrybucji, jednak ich zastosowanie jest ograniczone przez czas połowicznego rozpadu radiotracerów używanych do znakowania związków lub nanomateriałów, szczególnie w przypadku tracerów PET. Obrazowanie optyczne może być stosowane u małych gryzoni, ale nie może zostać przeniesione na zastosowania u ludzi, z wyjątkiem obszarów łatwo dostępnych, takich jak guzy powierzchniowe, ze względu na absorpcję i rozpraszanie światła. Ponadto, z tych samych powodów trudna jest kwantyfikacja sygnałów optycznych. MRI wykorzystuje trwałe znaczniki, takie jak SPIO, które mogą być śledzone w organizmie przez okres wielu tygodni. Metodę tę należy jednak stosować z ostrożnością, ponieważ znacznik może zostać przeniesiony do innych komórek lub wchłonięty przez organizm.

Specyficzność detekcji SPIO w MRI może być zapewniona za pomocą różnych metod. Metody detekcji, które dostarczają sygnałów zarówno pozytywnych, jak i negatywnych, są stosowane w celu poprawy specyficzności MRI w wykrywaniu obecności SPIO w tkankach. Metoda subtrakcyjna zastosowana w niniejszej pracy była wykorzystywana również przez innych autorów28. Inne podejścia obejmują detekcję poza rezonansem29-31, obrazowanie z czułością fazową, które generuje charakterystyczny wzorzec w pobliżu obszarów pustki SPIO32, oraz obrazowanie z zerowym czasem echa, wykorzystujące ważenie T1 w celu uzyskania pozytywnej intensywności sygnału w regionie SPIO33. Rozwój tych metod w celu poprawy ilościowego oznaczenia znacznika, czułości i specyficzności jest obecnie obszarem aktywnych badań.

Oświadczenia

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Praca została sfinansowana z grantów 1K25MH089851, 1P01DA028555-01A1, 2R01 NS034239, 2R37 NS36126, P01 NS31492, P20RR 15635, P01MH64570 oraz P01 NS43985 przyznanych przez National Institutes of Health. Autorzy dziękują pani Robin Taylor za krytyczne przeczytanie rękopisu oraz wybitne wsparcie graficzne i literackie. Autorzy chcieliby również podziękować Erin McIntyre, Melissie Mellon i Lindsay Rice za wsparcie techniczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Izofluran
Tlen medyczny
Waporyzator izofluranu
Maska do znieczulenia gazowego dla gryzoni
Stereotaktyczny uchwyt głowy kompatybilny z MRI
Strzykawka
Rurka do cewnika polietylenowego
Igła niemagnetyczna
Smar do oczu
Gaza
Taśma
Medium perfuzyjne
Związek OCT do zatapiania tkanek
System MRI
Aparat cyfrowy
Kriostat do sekcjonowania tkanek

Bibliografia

  1. Nowacek, A., Gendelman, H. E. NanoART neuroAIDS and CNS drug delivery. Nanomedicine (Lond). 4, 557-574 (2009).
  2. Nowacek, A., Kosloski, L. M., Gendelman, H. E. Neurodegenerative disorders and nanoformulated drug development. Nanomedicine (Lond). 4, 541-555 (2009).
  3. Nowacek, A. S., Miller, R. L., McMillan, J. NanoART synthesis, characterization, uptake, release and toxicology for human monocyte-macrophage drug delivery. Nanomedicine (Lond). 4, 903-917 (2009).
  4. Herbein, G., Varin, A. The macrophage in HIV-1 infection: from activation to deactivation. Retrovirology. 7, 33-33 (2010).
  5. Qian, B. Z., Pollard, J. W. Macrophage diversity enhances tumor progression and metastasis. Cell. 141, 39-51 (2010).
  6. Nathan, C., Ding, A. Nonresolving inflammation. Cell. 140, 871-882 (2010).
  7. McNeill, E., Channon, K. M., Greaves, D. R. Inflammatory cell recruitment in cardiovascular disease: murine models and potential clinical applications. Clin Sci (Lond). 118, 641-655 (2010).
  8. Bondeson, J. Activated synovial macrophages as targets for osteoarthritis drug therapy. Curr Drug Targets. 11, 576-585 (2010).
  9. Benoit, L. A., Holtzman, M. J. New immune pathways from chronic post-viral lung disease. Ann N Y Acad Sci. 1183, 195-210 (2010).
  10. Beduneau, A., Ma, Z., Grotepas, C. B. Facilitated monocyte-macrophage uptake and tissue distribution of superparmagnetic iron-oxide nanoparticles. PLoS One. 4, e4343-e4343 (2009).
  11. Dou, H., Grotepas, C. B., McMillan, J. M. Macrophage delivery of nanoformulated antiretroviral drug to the brain in a murine model of neuroAIDS. J Immunol. 183, 661-669 (2009).
  12. Liu, Y., Uberti, M. G., Dou, H. Ingress of blood-borne macrophages across the blood-brain barrier in murine HIV-1 encephalitis. J Neuroimmunol. 200, 41-52 (2008).
  13. Hetherington, H. P., Chu, W. J., Gonen, O., Pan, J. W. Robust fully automated shimming of the human brain for high-field 1H spectroscopic imaging. Magn Reson Med. 56, 26-33 (2006).
  14. Hasan, K. M., Parker, D. L., Alexander, A. L. Comparison of gradient encoding schemes for diffusion-tensor MRI. J Magn Reson Imaging. 13, 769-780 (2001).
  15. Hasan, K. M., Basser, P. J., Parker, D. L., Alexander, A. L. Analytical computation of the eigenvalues and eigenvectors in DT-MRI. J Magn Reson. 152, 41-47 (2001).
  16. Neeman, M., Freyer, J. P., Sillerud, L. O. A simple method for obtaining cross-term-free images for diffusion anisotropy studies in NMR microimaging. Magn Reson Med. 21, 138-143 (1991).
  17. Uberti, M. G., Boska, M. D., Liu, Y. A semi-automatic image segmentation method for extraction of brain volume from in vivo mouse head magnetic resonance imaging using Constraint Level Sets. J of Neurosci Methods. 179, 338-344 (2009).
  18. Liu, Y., Uberti, M. G., Dou, H., Mosley, R. L., Gendelman, H. E., Boska, M. D. An Image Warping Technique for Rodent Brain MRI-Histology Registration Based On Thin-Plate Splines with Landmark Optimization. Proc Soc Photo Opt Instrum Eng. 7259, 72592-K-72597-K (2009).
  19. Uberti, M. G., Liu, Y., Dou, H., Mosley, R. L., Gendelman, H. E., Boska, M. Registration of in vivo MR to histology of rodent brains using blockface imaging. Proc Soc Photo Opt Instrum Eng. 7262, 726213-726213 (2009).
  20. Basser, P. J., Mattiello, J., LeBihan, D. Estimation of the effective self-diffusion tensor from the NMR spin echo. J Magn Reson B. 103, 247-254 (1994).
  21. Hasan, K. M., Narayana, P. A. Retrospective measurement of the diffusion tensor eigenvalues from diffusion anisotropy and mean diffusivity in DTI. Magn Reson Med. 56, 130-137 (2006).
  22. Ratiney, H., Sdika, M., Coenradie, Y., Cavassila, S., Ormondt, D. van, Graveron-Demilly, D. Time-domain semi-parametric estimation based on a metabolite basis set. NMR Biomed. 18, 1-13 (2005).
  23. Naressi, A., Couturier, C., Castang, I., Beer, R. de, Graveron-Demilly, D. Java-based graphical user interface for MRUI, a software package for quantitation of in vivo/medical magnetic resonance spectroscopy signals. Comput Biol Med. 31, 269-286 (2001).
  24. Boska, L. ewis, Destache, T. B., J, C. Quantitative 1H magnetic resonance spectroscopic imaging determines therapeutic immunization efficacy in an animal model of Parkinson's disease. J Neurosci. 25, 1691-1700 (2005).
  25. Mosley, R. L., Benner, E. J., Kadiu, I. Neuroinflammation, Oxidative Stress and the Pathogenesis of Parkinson's Disease. Clin Neurosci Res. 6, 261-281 (2006).
  26. Nelson, J. A., Dou, H., Ellison, B. Coregistration of quantitative proton magnetic resonance spectroscopic imaging with neuropathological and neurophysiological analyses defines the extent of neuronal impairments in murine human immunodeficiency virus type-1 encephalitis. J Neurosci Res. 80, 562-575 (2005).
  27. Boska, H. asan, Kibuule, K. M., D, Quantitative diffusion tensor imaging detects dopaminergic neuronal degeneration in a murine model of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 26, 590-596 (2007).
  28. Liu, W., Frank, J. A. Detection and quantification of magnetically labeled cells by cellular MRI. Eur J Radiol. 70, 258-264 (2009).
  29. Balchandani, P., Yamada, M., Pauly, J., Yang, P., Spielman, D. Self-refocused spatial-spectral pulse for positive contrast imaging of cells labeled with SPIO nanoparticles. Magn Reson Med. 62, 183-192 (2009).
  30. Stuber, M., Gilson, W. D., Schar, M. Positive contrast visualization of iron oxide-labeled stem cells using inversion-recovery with ON-resonant water suppression (IRON). Magn Reson Med. 58, 1072-1077 (2007).
  31. Suzuki, Y., Cunningham, C. H., Noguchi, K. In vivo serial evaluation of superparamagnetic iron-oxide labeled stem cells by off-resonance positive contrast. Magn Reson Med. 60, 1269-1275 (2008).
  32. Kim, Y. B., Bae, K. H., Yoo, S. S., Park, T. G., H, P. ark Positive contrast visualization for cellular magnetic resonance imaging using susceptibility-weighted echo-time encoding. Magn Reson Imaging. 27, 601-610 (2009).
  33. Zhou, R., Idiyatullin, D., Moeller, S. SWIFT detection of SPIO-labeled stem cells grafted in the myocardium. Magn Reson Med. 63, 1154-1161 Forthcoming.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie rezonansem magnetycznymsuperparamagnetyczny tlenek elazakorejestracja histologicznaobrazowanie tensora dyfuzjibiodystrybucja nanocz steczektesty pobierania przez kom rkimyszy z zapaleniem m zgu wywo anym przez HIV 1nieprawid owo ci spektroskopoweanaliza sk adu chemicznego m zgumonitorowanie skuteczno ci terapeutycznej
Rejestrowane obrazowanie biomedyczne nanomateriałów w monitorowaniu diagnostyki i terapii
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.