Dostarczanie genów za pośrednictwem bakteriofagów u bakterii krętkowatych

Streszczenie

Źródło: Eggers, C. H. Phage-Mediated Genetic Manipulation of the Lyme Disease Spirochete Borrelia burgdorferi. J. Vis. Exp. (2022).

W niniejszym materiale wideo przedstawiono transdukcję genetycznie zmodyfikowanych krętków z rodzaju Borrelia z wykorzystaniem nieinfekcyjnych bakteriofagów wytrąconych glikolem polietylenowym, niosących plazmid z opornością na kanamycynę. Po inkubacji z bakteriami kulturę wysiewa się na podłoże uzupełnione antybiotykiem. Przeżywają i tworzą kolonie jedynie komórki, które otrzymały plazmid. Kolonie te są następnie selekcjonowane i namnażane w płynnym podłożu zawierającym antybiotyk w celu uzyskania stabilnej populacji bakterii niosących plazmid do dalszych zastosowań

Protokół

1. Test transdukcji po wytrącaniu bakteriofaga φBB-1 za pomocą PEG (glikolu polietylenowego)

1. Przygotować kultury B. burgdorferi do wykorzystania jako biorca w testach transdukcji. Na podstawie określonej gęstości obliczyć objętość kultury biorcy niezbędną do uzyskania 15 mL zawiesiny o stężeniu 1 × 107 spirochetes·mL−1.
2. Odwirować tę objętość kultury z prędkością 6,000 x g przez 10 min. Odlać nadsącz i resuspender osad w 14,5 mL świeżego podłoża BSK (Barbour-Stoenner-Kelly).
3. Dodać ≤500 µL próbki fagów wytrąconych za pomocą PEG do kultury klonu biorcy. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 33 °C przez 72-96 h.
   UWAGA: Ilość fagów odzyskanych podczas wytrącania PEG może być zmienna, w zależności od wielu czynników. Jednakże w przypadku 15 mL kultury indukowanego szczepu B. burgdorferi CA-11.2A, 500 µL zazwyczaj zawiera 50-1,000 żywych fagów28. Objętości odzyskanego faga ≥500 µL niekorzystnie wpływają na wzrost B. burgdorferi, prawdopodobnie ze względu na zwiększony stosunek SM (Suspension Medium) do BSK.
4. Przeprowadzić selekcję transduktantów poprzez wysiew na podłoże stałe po zmieszaniu z fagami wytrąconymi za pomocą PEG.

2. Selekcja transduktantów

UWAGA: Posiew na podłożu stałym w celu wyselekcjonowania potencjalnych transduktantów wykonuje się z zastosowaniem modyfikacji protokołu polegającej na utworzeniu pojedynczej warstwy. Kolonie B. burgdorferi rosną wewnątrz agaru, dlatego w przypadku selekcji transduktantów metodą posiewu na podłożu stałym, próbki należy dodać do podłoża podczas wlewania go na płytki. Technika ta może być również skuteczna w selekcji transduktantów, lecz nie została jeszcze w tym celu przetestowana.

1. Określ liczbę płytek potrzebnych do selekcji transduktantów na podstawie liczby próbek z testów transdukcji oraz kontroli, które mają zostać wysiane.
   UWAGA: Zazwyczaj na każdą próbkę przygotowuje się dwie płytki: jedną zawierającą około 10% objętości hodowli i drugą z pozostałą częścią hodowli. Dodatkowo przygotuj płytki służące jako kontrole negatywne, aby indywidualnie sprawdzić, czy preparat fagowy i/lub klony rodzicielskie użyte jako dawca i biorca nie rosną w obecności antybiotyku(ów) stosowanych podczas selekcji. Zaleca się również przygotowanie materiału do wysiewu na co najmniej dwie dodatkowe płytki. Na przykład, jeśli liczba próbek i kontroli do wysiewu wynosi osiem, przygotuj mieszankę do wysiewu na 10 płytek.
2. Przygotuj roztwory do wysiewu zgodnie z poniższym opisem.
   UWAGA: Każda płytka będzie miała objętość 30 mL, składającą się z 20 mL 1,5x BSK do wysiewu i 10 mL 2,1% agarozy (stosunek 2:1). Przyniesie to płytkę z końcowymi stężeniami 1x BSK i 0,7% agarozy. Na przykład dla 10 płytek przygotuj całkowitą mieszankę do wysiewu o objętości 300 mL, składającą się z 200 mL 1,5x BSK i 100 mL 2,1% agarozy.
   1. Przygotuj 1 L 1,5x BSK, stosując ilości każdego składnika wymienione dla 1,5x BSK. Przechowuj zgodnie z opisem dla 1x BSK.
   2. Przygotuj 2,1% agarozę w wodzie i wysterylizuj w autoklawie. Używaj świeżego roztworu agarozy lub przechowuj go w temperaturze pokojowej. Jeśli roztwór jest przechowywany w temperaturze pokojowej, podgrzewaj go w mikrofalówce z luźno zamkniętą pokrywką, aż całkowicie się rozpuści, przed przystąpieniem do wysiewu.
   3. Określ objętość antybiotyku(ów) potrzebną do uzyskania odpowiedniego stężenia w całej mieszance do wysiewu.
      UWAGA: Jeśli całkowita objętość końcowego roztworu do wysiewu wynosi 300 mL, zmieszaj 200 mL 1,5x BSK i odpowiednią ilość antybiotyku, aby zapewnić, że całe 300 mL będzie miało prawidłowe końcowe stężenie antybiotyku. Jeśli zarówno dawca, jak i biorca w teście transdukcji posiadają różne geny oporności na antybiotyki, mieszanka do wysiewu powinna zawierać oba antybiotyki. Jeśli fag wytrącony PEG-iem od dawcy koduje marker oporności na antybiotyk, a biorca go nie posiada, mieszanka do wysiewu powinna zawierać tylko jeden antybiotyk.
3. Na podstawie liczby płytek do przygotowania przenieś odpowiednią ilość 1,5x BSK i antybiotyku(ów) do sterylnej butelki wystarczająco dużej, aby pomieścić całą mieszankę do wysiewu. Inkubuj w kąpieli wodnej w temperaturze 56 °C przez ≥15 min.
4. Inkubuj roztopioną agarozę z autoklawu lub mikrofalówki w kąpieli wodnej w temperaturze 56 °C przez ≥15 min.
5. Po wyrównaniu temperatury dodaj wyznaczoną ilość 2,1% agarozy do butelki z 1,5x BSK (z antybiotykiem) i umieść roztwór do wysiewu ponownie w kąpieli wodnej w temperaturze 42 °C na 10-15 min.
   UWAGA: Wyższe temperatury mogą uszkodzić lub zabić spirochety36. W przypadku korzystania z tej samej kąpieli wodnej co powyżej, schłodź ją do 42-45 °C przed uruchomieniem czasomierza inkubacji. Nie pozwól, aby roztwór do wysiewu inkubował się w temperaturze 42 °C dłużej niż 20 min, w przeciwnym razie zacznie twardnieć podczas wlewania na płytki.
6. Podczas inkubacji przygotuj próbki B. burgdorferi do wysiewu. Przenieś ilość przeznaczoną do wysiewu do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej 50 mL.
7. Jeśli wysiewana ilość jest mniejsza niż 1,5 mL (<5% końcowej objętości płytki 30 mL), przenieś próbkę do nowej probówki i dodaj mieszankę do wysiewu bezpośrednio do próbki podczas wysiewu.
   1. W przypadku większych objętości przenieś pożądaną objętość hodowli do nowej probówki, a następnie wiruj przy 6 000 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej. Odlej cały supernatant z wyjątkiem 100-500 µL i wykorzystaj pozostałą ilość do całkowitego resuspensowania osadu przed wysiewem.
   2. W przypadku płytek kontrolnych po ko-hodowli, dodaj ≥107 komórek klonów dawcy lub biorcy do sterylnych stożkowych probówek wirówkowych 50 mL. Jeśli objętość przekracza 1,5 mL, odwiruj i resuspenderuj osad. Jeśli test transdukcji został przeprowadzony przy użyciu faga wytrąconego PEG-iem, oprócz klona biorcy dodaj 100-250 µL próbki faga do sterylnej stożkowej probówki 50 mL w celu wysiewu.
8. Po inkubacji roztworu do wysiewu w temperaturze 42-45 °C przez 10-15 min, przenieś 30 mL roztworu do probówki z odpowiednią próbką; niezwłocznie wlej mieszankę do wysiewu wraz z próbką na opisaną płytkę. Powtórz czynność, używając nowej pipety dla każdej próbki do wysiewu.
9. Pozostaw płytki do zastygnięcia na 15-20 min, a następnie umieść je w inkubatorze w temperaturze 33 °C z dodatkiem 5% CO₂. Nie odwracaj płytek przez co najmniej 48 h po wylaniu.
10. W zależności od tła klona biorcy, sprawdź, czy w agarozy na płytkach selekcyjnych pojawiły się kolonie po 10-21 dniach inkubacji. Wybierz co najmniej 5-10 kolonii rosnących na płytce w obecności obu antybiotyków za pomocą wysterylizowanej borokrzemowej pipety 5,75 cala z bawełnianym czopkiem i zaszczep je do 1,5 mL 1x BSK z odpowiednim antybiotykiem(ami).
11. Hoduj zaszczepione kolonie w temperaturze 33 °C przez 3-5 dni lub do momentu osiągnięcia gęstości około 20-40 spirochet na pole widzenia przy powiększeniu 200x w mikroskopii ciemnopoliowej.
    UWAGA: Po przesiewaniu spirochety można zamrozić do długotrwałego przechowywania w temperaturze −80 °C, mieszając równą objętość hodowli z mieszaniną 60% glicerolu i 40% 1x BSK wysterylizowaną przez filtrację przez filtr 0,22 µm.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Stożkowe probówki wirówkowe 15 mL (polipropylenowe)	USA Scientific	5618-8271
Mitomycyna C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	OSTRZEŻENIE: potencjalny kancerogen; stosować wyłącznie w dygestorium chemicznym
Pipety Pasteura 5,75" (z bawełnianym czopkiem/szkło borokrzemowe/nisterylne)	Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	Autoklawować przed użyciem
Stożkowe probówki wirówkowe 50 mL (polipropylenowe)	USA Scientific	1500-1211
Etanol bezwodny
Erytromycyna	Research Products International Corp	E57000-25.0
Roztwór odczynnika gentamycyny	Gibco	15750-060
Glukoza (dekstroza bezwodna)	Thermo Fisher Scientific	BP350-500
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-500
Siarczan kanamycyny	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0