Wprowadzanie genów do jelitowych organoidów mysich przy użyciu wektorów lentiwirusowych

Streszczenie

Źródło: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015)

W niniejszym filmie opisano transdukcję lentiwirusem organoidów jelita myszy pochodzących z zawiesiny zawierającej struktury przypominające krypty. Wykorzystując macierz błony podstawnej jako rusztowanie oraz pożywki uzupełnione czynnikami wzrostu, wprowadzane są wektory lentiwirusem w celu umożliwienia stabilnej integracji genów

Protokół

Transdukcja lentiwirusem organoidów

Dzień 0:

1. Na dwa dni przed transdukcją przenieś organoidy z pełnej studzianki o powierzchni 0,95 cm² do nowej studzianki, dążąc do uzyskania około 50 małych organoidów. Rozdziel organoidy (Rysunek 1A, B).
2. Uzupełnij pożywkę do hodowli organoidów o 10 µM Chir9021 oraz 10 mM nikotynamid, aby uzyskać cystyczne krypty hiperproliferacyjne (Rysunek 1C).
   UWAGA: Krypty cystyczne rozwijają się najlepiej, gdy świeżo rozdzielone organoidy są hodowane w obecności Chir99021.

Dzień 2:

3. Zebrać organoidy, pipetując matrigel i medium w górę i w dół, rozbijając w ten sposób mieszaninę za pomocą mikropipety p10. Przenieść mieszaninę do probówki o pojemności 15 mL.
4. Dalej rozbijać organoidy za pomocą pipety Pasteura, której otwór dystalny został zwężony przez stopienie. Wirować organoidy w celu utworzenia osadu przez 5 min przy 10 x g.
   UWAGA: W zależności od rozmiaru wirówki należy zastosować inną prędkość wirowania. Konieczne jest ustalenie dokładnej prędkości, przy której rozbite organoidy zostaną oddzielone od mieszaniny.
5. Usunąć nadsącz i dodać 50 µL uprzednio ogrzanej trypsyny 1x (odpowiednik trypsyny 0,25%). Resuspender organoidy w trypsynie i inkubować przez 3 min w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
6. Inaktywować trypsynę, dodając 3,5 mL pożywki do hodowli linii komórkowych [Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnione o 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS), 1% penicyliny/streptomycyny i glutaminę]. Wirować przez 5 min przy 500 x g.
7. Usunąć nadsącz, pozostawiając osad w około 20 µL pożywki. Przenieść organoidy w tej niewielkiej ilości pożywki do dołka na płytce 48-dołkowej.
8. Dodać lentiwirus o wysokim mianie w medium do transdukcji, resuspender i przejść do kroku 3.10 w przypadku niskiej wydajności transdukcji.
   UWAGA: Aby zapewnić wydajną transdukcję, zazwyczaj dodaje się jedną porcję 250 µL lentiwirusa o wysokim mianie do jednego dołka z organoidami. Stanowi to 50% wszystkich zebranych lentiwirusów z jednej produkcji.
9. Opcjonalnie: aby zwiększyć wydajność transdukcji, przeprowadzić spinokulację, umieszczając płytkę 48-dołkową z organoidami w ogrzanej wcześniej wirówce w temperaturze 32 °C i wirując przy 600 x g przez 1 h.
10. Umieścić mieszaninę organoidów i wirusa w inkubatorze i inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli, aby umożliwić transdukcję.
11. Opcjonalnie: aby dodatkowo zwiększyć wydajność transdukcji, inkubować organoidy przez dodatkowe 3 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli.
12. Dodać 1 mL pożywki do hodowli organoidów i resuspender mieszaninę organoidów i wirusa, przenieść do probówki do mikrowirówki i wirować w mikrowirówce przez 5 min przy 850 x g, aby uzyskać osad z organoidów.
13. Usunąć nadsącz i resuspender osad w 20 µL lodowatego Matrigelu. Ponieważ materiał twardnieje po ogrzaniu, należy użyć końcówek do pipet schłodzonych poprzez kilkukrotne pipetowanie lodowatego PBS w górę i w dół.
14. Umieścić kroplę na środku dołka w płytce 48-dołkowej i inkubować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 15 min do momentu stwardnienia.
15. Po 15 min ostrożnie dodać 250 µL pożywki do hodowli organoidów uzupełnionej o 10 mM nikotynamid, 10 µM Chir99021 i 10 µM Y27632. Małe, rozbite fragmenty organoidów utworzą małe organoidy cystyczne w ciągu 24 h.

Dzień 5:

16. Wymień medium i uzupełnij je o antybiotyki selekcyjne (w przypadku puromycyny zastosuj stężenie 4 µg/mL).

Dzień 7:

1. Wymień pożywkę na standardową pożywkę do hodowli organoidów, uzupełnioną o antybiotyk selekcyjny.
   UWAGA: Pączkowanie zakończy się 2-3 tygodnie po odstawieniu Chir9021. Po selekcji organoidy można hodować bez antybiotyków selekcyjnych.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat produkcji lentiwirusa do transdukcji organoidów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Polyethylenimina	Polysciences	23966-2
pożywka DMEM	Lonza	BE12-614F
Surowica cielęca płodowa	Lonza	DE14-801F
Penicylina-streptomycyna	Invitrogen	15140-122
Glutamina	Invitrogen	25030-024
Matrigel	BD	BD 356231
Advanced DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-acetylocysteina	Sigma	A9165-1G
Mysi Egf	Invitrogen	PMG8045
HEPES 1 M	Invitrogen	15630-056
Glutamax 10x	Invitrogen	35050-038
Chir 9021	Akson	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
Polybrene	Sigma	107689
Nikotynamid	Sigma	N0636
Trypsyna	Lonza	BE02-07E