Wykrywanie aktywacji szlaku SMAD z wykorzystaniem podwójnej transdukcji adenowirusowej

Streszczenie

Źródło: Chen, H., et al. Live Cell Imaging of the TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (2018).

Niniejszy film prezentuje metodę badania aktywacji szlaku SMAD w komórkach raka piersi z wykorzystaniem podwójnej infekcji adenowirusowej. Jeden wirus dostarcza konstytutywnie ekspresowany gen GFP, natomiast drugi niesie reporter RFP pod promotorem wrażliwym na SMAD. Po stymulacji TGF-beta białka SMAD ulegają aktywacji, tworząc kompleks, który indukuje ekspresję RFP. Wykrycie podwójnych sygnałów w żywych komórkach potwierdza aktywację szlaku.

Protokół

1. Podwójna transdukcja adenowirusowa w żywych pojedynczych komórkach

1. Wysiać 1,0 - 1,5 x 10⁵ komórek MDA-MB-231 w 500 μL pożywki DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) zawierającej 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) do każdego dołka płytki 12-dołkowej (konfluencja komórek 35%, łącznie 2 dołki).
2. Zainfekować komórki, dodając 75 μL wektora adenowirusowego Ad-CMV-GFP (miano = 5 x 10⁹ PFU/mL) oraz 7,5 μL wektora adenowirusowego Ad-CAGA12-Td-Tom (miano = 5 x 10¹⁰ PFU/mL), aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) wynoszącą 2500, co pozwala na osiągnięcie 100% pozytywności infekcji.
3. Bezpośrednio po infekcji adenowirusami poddać komórki działaniu 0,25 μL czynnika wzrostu TGF-β (transforming growth factor-beta) na dołek (stężenie w roztworze stokowym 10 mg/mL, stężenie końcowe 5 ng/μL) lub nie traktować ich tym czynnikiem.
4. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy zawartości 10% CO₂ na 24 h.
5. Wykonać obrazowanie żywych komórek za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu fazowego. Pobudzić zielone białko fluorescencyjne (GFP) przy 470 nm oraz białko Td-Tomato przy 554 nm.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	ThermoFisher	1881024	Podgrzać w kąpieli wodnej 37 °C przed użyciem
Płócawołowa surowica (FBS)	Scientifix Life	FBS500-S	Inaktywować termicznie przed użyciem
Rekombinowany ludzki TGF-β1	PEPROTECH	100-21	Rozdzielić w DDW, aby uzyskać stężenie końcowe 10 mg/mL
Mikroskopia fluorescencyjna z kontrastem fazowym	OLYMPUS	IX50
MDA-MB-231	ATCC	CRM-HTB-26
Roztwór			Skład
FBS-DMEM			5% inaktywowane termicznie FBS; 10 μg/mL penicyliny; 100 μg/mL streptomycyny