Multipleksowe obrazowanie fluorescencyjne kwasów nukleinowych i białek wirusowych w zakażonych limfocytach ludzkich

Streszczenie

Źródło: Shah, R., et al. Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection. J. Vis. Exp. (2020)

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano jednoczesną wizualizację DNA, RNA oraz białka kapsydu HIV-1 w zakażonych limfocytach ludzkich z wykorzystaniem hybrydyzacji rozgałęzionego DNA (bDNA) oraz immunofluorescencji, co umożliwia szczegółową analizę etapów replikacji wirusa w poszczególnych komórkach.

Protokół

1. Immunobarwienie białek: w celu oznakowania białek zainteresowania

1. Odlej PBS (bufor fosforanowy) i dodaj do szkiełka podstawowego 200 µL buforu blokującego (1% w/v BSA (albumina surowicy wołowej), 10% v/v FBS (płodowa surowica wołowa) w PBS z 0,1% v/v Tween-20 (PBST)). Inkubuj przez 1 h w RT (temperaturze pokojowej).
2. Odlej bufor blokujący i nanieś 200 µL przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w PBST + 1% w/v BSA. Inkubuj przez 1 h w RT.
3. Przemyj preparat dwukrotnie PBST przez 10 min w RT przy wstrząsaniu.
4. Nanieś wybrane przeciwciało wtórne na 1 h w RT w PBST + 1% w/v BSA.
5. Przemyj preparat PBST przez 10 min w RT przy wstrząsaniu.

2. Barwienie jąder: Barwienie kontrastowe jąder po immunobarwieniu

1. Odlać PBST i nanieść DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) lub wybrany barwnik jądrowy na 1 min w RT.
2. Przemyć preparat dwukrotnie PBS przez 10 min w RT przy potrząsaniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało Anti-HCV NS5a	Abcam	ab13833	Mysie monoklonalne; działa z genotypami HCV 1a, 1b, 3 i 4
Monoklonalne przeciwciało Anti-HIV-1 p24	NIH AIDS Reagent Program	3537
Przeciwciało Anti-Mov10	Abcam	ab80613	Królicze poliklonalne
Albuminy surowicy bydlęcej			Odczynnik blokujący do immunobarwienia
Pożywka komórkowa z suplementami			Pożywka odpowiednia dla modelu komórkowego
Łaseczki
DAPI	ACD Bio		Barwnik jądrowy (zestaw RNAscope od ACD Bio
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym Dulbecco (1X PBS)	Gibco	14190250	Bez wapnia i magnezu
Płodowa surowica bydlęca (FBS)			Należy użyć konkretnej FBS w zależności od surowicy, w której wytworzono przeciwciało wtórne (np. kozia FBS)
Fisherbrand colorfrost plus microscope slides	Fisher Scientific	12-550-17/18/19	Wstępnie oczyszczone
Szkiełka
Tween-20			Do buforu hybrydyzacyjnego DNA i PBS-T