Oczyszczanie intasomów prototypowego wirusa piankowatego (PFV) metodą chromatografii wykluczania cząsteczkowego

Streszczenie

Źródło: Mackler, R. M., et al. Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes. J. Vis. Exp. (2018)

W tym filmie przedstawiono oczyszczanie intasomów wirusa pienistego prototypowego (PFV) z mieszanej zawiesiny białkowo-DNA przy użyciu ekstrakcji solnej i chromatografii żelowej (SEC), co pozwala na uzyskanie aktywnych kompleksów do dalszych analiz.

Protokół

1. Solubilizacja intasomów

1. Przygotuj dwa końce pipet o szerokim wlocie, odcinając 2-4 mm z końcówki pipety 20 µL za pomocą nowej żyletki lub ostrza skalpela na czystej powierzchni.
   UWAGA: Końcówki te zostaną wykorzystane w krokach 1.3 i 1.5.
2. Wyjmij rurkę dializacyjną z buforu do dializy. Aby zapobiec rozcieńczeniu próbki intasomu buforem dializacyjnym, który może pozostać na końcu rurki w pobliżu zacisku, użyj mikropipety z wąską końcówką, aby usunąć nadmiar buforu. Zdejmij zacisk z jednego końca rurki dializacyjnej.
3. Użyj końcówki pipety o szerokim wlocie z kroku 1.1, aby przenieść próbkę wraz z osadem z wnętrza rurki dializacyjnej do probówki 1,5-mL na lodzie. 
   UWAGA: Całkowita objętość odzyskanego materiału wynosi zazwyczaj ~140 µL.
4. Próbka z osadem znajduje się w 20 mM NaCl; zwiększ stężenie soli do końcowego poziomu 320 mM NaCl, dodając odpowiednią objętość roztworu stokowego 5 M NaCl. Na przykład dla próbki 150 µL dodaj 3,9 µL 5 M NaCl i 1,1 µL ddH₂O, aby uzyskać końcową objętość 15 µL. Przenieś wiadro z lodem i próbką do pomieszczenia chłodniczego o temperaturze 4 ˚C.
5. Użyj końcówki pipety o szerokim wlocie z kroku 1.1, aby resuspendować i rozpuścić osad poprzez pipetowanie. Powtarzaj czynność co 20 min przez co najmniej 1 h. Obserwuj, czy większość osadu przeszła do roztworu.
   UWAGA: Pipetowanie w celu resuspensji osadu można przerwać, gdy stanie się jasne, że ilość osadu nie zmniejsza się już zauważalnie między poszczególnymi punktami czasowymi. Gdy vDNA nie jest znakowany lub jest znakowany wewnętrznie, osad zmniejsza się o ~90% w ocenie wizualnej. W przypadku vDNA znakowanego na końcach Cy5, osad zmniejsza się tylko o ~20%; większość osadu z vDNA znakowanym na końcach fluorochromem nie rozpuści się. Ilość osadu, która ulega efektywnemu rozpuszczeniu, jest zmienna i powinna zostać określona empirycznie.

2. Oczyszczanie intasomów

1. Przygotować 250 mL buforu do prowadzenia chromatografii żelowej (SEC) (20 mM Bis-tris propane, pH 7,5, 320 mM NaCl, 10% glicerolu). Przefiltrować bufor sterylnie za pomocą jednostki filtrującej 0,2 µm i przechowywać w temperaturze 4 ˚C.
   UWAGA: Wszystkie etapy oczyszczania przeprowadza się w chłodni o temperaturze 4 ˚C.
2. Równoważyć kolumnę SEC z sieciowanej agarozy (średnica = 10 mm; długość = 30 mm; objętość łoża = 24 mL; objętość próbki = 25 - 50 µL; maksymalne ciśnienie = 1,5 MPa; granica wykluczenia = 4 x 10⁷ Da; rozdziela masy cząsteczkowe od 5 do 5 0 kDa, patrz Tabela Materiałów) buforem do SEC przy szybkości przepływu 0,4 mL/min.
   UWAGA: Metodę oczyszczania można dostosować do różnych kolumn do wykluczania molekularnego, o ile są one w stanie skutecznie oddzielić cząsteczki o masie 30 kDa od 4 kDa, np. Superose 12 10/30 GL lub Superose 6 Increase. Kolumna Superose 12 10/30 GL ma niższą rozdzielczość, co prowadzi do większego nakładania się pików. Z kolei Superose 6 Increase ma wyższą rozdzielczość i zapewnia lepsze rozdzielenie.
3. Wirować próbkę intasomu w mikrocentry fudze przy 14 0 x g przez 10 min w temperaturze 4 ˚C, aby wytrącić pozostały osad. Ostrożnie usunąć nadsącz. Nanieść nadsącz do pętli wtryskowej o objętości 20 µL (przewód mogący pomieścić ~20 μL). Aplikować próbkę na kolumnę SEC.
   UWAGA: Mniejsze objętości nakładki pozwalają na uzyskanie większej rozdzielczości w SEC.
4. Eluować 25 mL buforu do SEC i zebrać 95 frakcji po 270 µL każda. Zauważyć, że chromatogram SEC wykazuje trzy piki A₂₈₀/A₂₆₀ (Rycina 1).
   UWAGA: Pierwszy pik powinien odpowiadać agregatom (~9,0 - 1,5 mL elucji), następnie powinien pojawić się pik tetramerycznego intasomu PFV (~12,0 - 14,75 mL elucji) oraz pik monomeru PFV IN z wolnym vDNA (~15,0 - 18,0 mL).

Wyniki

Rysunek 1: Chromatogram wykluczania siewnego. Zestaw intasomu PFV został rozdzielony przy użyciu kolumny SEC z agarozy. Kolumna ta umożliwia oddzielenie agregatu (1), intasomu PFV składającego się z tetrameru PFV IN i dwóch cząsteczek vDNA (2) oraz monomerycznego PFV IN i vDNA (3). W tym przykładzie zastosowano vDNA z wewnętrzną etykietą fluoroforu Cy5, wykrywaną przy wzbudzeniu 650 nm. Oś y oznacza gęstość optyczną (OD) w mili-jednostkach absorbancji (mAU).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oligonukleotydy DNA	IDT	N/A	Oligonukleotydy DNA na zamówienie
NaCl	P212121	RP-S23020
BIS-TRIS propana, >=9,0% (miareczkowanie)	Sigma-Aldrich	B675-50G
Glicerol	Thermo Fisher Scientific	G37-20
Napiwki do nakładania żelu, 1 - 200 μL	Corning	CLS4853-40EA
Żyletka; Jednostronna; 10 szt./opak.; Opakowanie 10 szt.	Fisher Scientific	12-640
Klipsy do rurek dializacyjnych	Spectrum Labs	132734
Rurki dializacyjne 6-8 kDa 10 mm	Spectrum Medical	132645
Superose 6 10/30 GL	GE Healthcare Life Sciences	17517201