Wyodrębnianie wirusowego RNA do analizy za pomocą ilościowej reakcji polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR)

Streszczenie

Źródło: Suzuki, Y., et al. Measuring Dengue Virus RNA in the Culture Supernatant of Infected Cells by Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction. J. Vis. Exp. (2018).

Niniejszy film prezentuje procedurę przygotowania próbek wirusowych do analizy za pomocą ilościowej PCR (reakcji łańcuchowej polimerazy). Próbki wirusowe i standardy RNA są rozcieńczane seryjnie, traktowane buforem z proteinazą K i inkubowane w kontrolowanych temperaturach w celu uwolnienia RNA. Przetworzone RNA jest następnie stabilizowane i przechowywane w celu ilościowego oznaczenia poziomów RNA wirusa.

Protokół

1. Przygotowanie próbek wirusa do RT-qPCR (ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej w czasie rzeczywistym)

UWAGA: Kroki 1.1–1.3 należy przeprowadzić w komorze bezpieczeństwa biologicznego. W szczególności obchodzenie się z nadsączem hodowlanym zawierającym zakaźnego wirusa musi odbywać się w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (lub wyższego).

1. Wymieszać 199 μL buforu do obróbki i 1 μL proteinazy K wolnej od nukleaz.
2. Wykonać rozcieńczenia szeregowe zsyntetyzowanego RNA (kwasu rybonukleinowego) 3’UTR (regionu nietranslacyjnego) DENV (wirusa dengi) w stosunku 1:10, aby uzyskać standard RNA o stężeniu od 5 x 10⁹ do 5 x 10³ kopii/μL, wykorzystując pożywkę do hodowli komórkowej (np. DMEM (pożywkę Eagle'a modyfikowaną przez Dulbecco) uzupełnioną o 10% płodowej surowicy bydlęcej i antybiotyki [DMEM/10% płodowa surowica bydlęca]) zawierającą 40 units/mL inhibitora RNazy.
3. Wymieszać 5 μL supernatantu z hodowli komórek zakażonych DENV oraz standard RNA 3’UTR DENV z 5 μL roztworu buforu do obróbki/proteinazy K, używając 8-probówkowych pasków do PCR (reakcji łańcuchowej polimerazy) lub płytki PCR 96-dołkowej. Jako kontrolę bez matrycy (NTC) wymieszać 5 μL pożywki do hodowli komórkowej (bez dodatku wirusa) z 5 μL roztworu buforu do obróbki/proteinazy K.
4. Po krótkim wirowaniu inkubować próbki w termocyklerze w następujących warunkach: 1 cykl (25 °C przez 10 min i 75 °C przez 5 min).
UWAGA: Obróbione próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C, jeśli analiza PCR w czasie rzeczywistym jest przeprowadzana tego samego dnia. Do długoterminowego przechowywania próbki należy zamrozić w temperaturze -80 °C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
SimpliAmp Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	A24811	Można zastosować porównywalny termocykler, jednak warunki cyklu PCR wymagają optymalizacji.
Recombinant RNase Inhibitor	Takara Bio. Inc	2313A	40 units/μL
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	Można zastosować porównywalny zestaw do oczyszczania RNA.
Proteinase K	Nacalai Tesque	15679-06	>600 units/mL. Można zastosować porównywalny odczynnik.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL	Thermo Fisher Scientific	4346907	W zależności od urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym można zastosować porównywalną płytkę lub probówkę, jednak warunki cyklu PCR wymagają optymalizacji.