Pozyskiwanie cząsteczek wirusa zapalenia wątroby E z ludzkich komórek raka wątroby

Streszczenie

Źródło: Meister, T. L., et al. Model hodowli komórkowej do produkcji wysokomianowych zapasów wirusa zapalenia wątroby E. J. Vis. Exp. (2020).

Niniejszy film demonstruje proces izolacji cząsteczek wirusa zapalenia wątroby typu E (HEV) z transfektowanych ludzkich komórek raka wątrobowokomórkowego. Pozakomórkowe cząsteczki wirusa są zbierane z przefiltrowanych nadsączów, natomiast cząsteczki wewnątrzkomórkowe są uwalniane poprzez poddanie komórek wielokrotnym cyklom zamrażania i rozmrażania. Lizat jest wirowany, a nadsącz zawierający cząsteczki HEV jest rozdzielany na alikwoty i przechowywany w ultra-niskiej temperaturze do późniejszego użycia

Protokół

1. Przygotowanie komórek HepG2 do produkcji HEV pochodzącego z hodowli komórkowych (HEVcc)
UWAGA: Aby uniknąć kontaminacji, przygotowanie komórek, elektroporacja, infekcja, zbieranie oraz fiksacja komórek były przeprowadzane w warunkach sterylnych w laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2. Etapy inkubacji w 37 °C z udziałem komórek realizowano w inkubatorze z 5% CO₂.

1. Aby przygotować komórki HepG2 do produkcji HEVcc (Rycina 1), wysiać komórki w kompletnej pożywce DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (patrz Tabela 1) na szalkę hodowlaną 15 cm pokrytą kolagenem (patrz Tabela 1, przed dodaniem kolagenu przefiltrować sterylnie mieszaninę fosforanu sodu w roztworze buforowanym (PBS) i kwasu octowego przez sito 0,2 µm). Inkubować w temperaturze 37 °C do momentu, aż komórki osiągną 90% konfluencji.
   UWAGA: Każda szalka 15 cm zawierająca komórki o 90% konfluencji dostarczy wystarczającą liczbę komórek do maksymalnie 4 elektroporacji.
2. Ostrożnie usunąć pożywkę z szalki i raz wypłukać komórki 10 mL 1x PBS. Trypsynizować komórki, dodając do nich 3 mL 0,05% trypsyny-EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C, aż komórki całkowicie się odkleją. Resuspendować komórki w 10 mL kompletnej pożywki DMEM i przenieść zawiesinę komórkową do probówki 50 mL. Określić całkowitą liczbę komórek.
3. Ponieważ każda elektroporacja wymaga 5 x 10⁶ komórek, przenieść odpowiednią objętość do nowej probówki 50 mL i dopełnić do co najmniej 35 mL za pomocą 1x PBS. Wirować komórki przy 200 x g przez 5 min i ostrożnie odlać nadsącz, nie naruszając osadu komórkowego.
4. Ponownie wypłukać komórki 35 mL 1x PBS, wirując przy 200 x g przez 5 min. Umieścić komórki na lodzie i nie usuwać jeszcze 1x PBS, aby utrzymać komórki w zawiesinie.

2. Elektroporacja komórek HepG2

1. Do elektroporacji komórek HepG2 (Rysunek 2) przygotuj 400 µL pełnego roztworu Cytomix na każdą elektroporację, uzupełniając 384 µL Cytomix (patrz Tabela 1) o 2 mM ATP i 5 mM glutationu. Przygotuj świeżo przed użyciem i umieść bezpośrednio na lodzie.
   UWAGA: Prawidłowe i szybkie wykonanie następnych kroków jest kluczowe. Dlatego należy upewnić się, że wszystko zostało odpowiednio przygotowane.
2. Ostrożnie usuń 1x PBS, nie naruszając osadu komórkowego z kroku 4.4. Resuspenduj 5 x 10⁶ komórek w 400 µL pełnego roztworu Cytomix i dodaj 5 µg RNA. Przenieś roztwór do kuwety 4 mm i poddaj jednorazowemu impulsowi 975 µF, 270 V przez 20 ms za pomocą systemu do elektroporacji.
   1. Po elektroporacji jak najszybciej przenieś komórki pipetą Pasteura do 11 mL pełnej pożywki DMEM na każdą elektroporację.
      UWAGA: Aby upewnić się, że RNA zostało pomyślnie przetransfekowane do komórek HepG2, zostanie przeprowadzona kontrola transfekcji (TC). Oczekiwany stopień transfekcji wynosi od 40-60% komórek pozytywnych pod kątem ORF2.
3. Przenieś 10 mL elektroporowanych komórek do naczynia hodowlanego 10 cm pokrytego kolagenem. Dodaj 1,3 x 10⁵ elektroporowanych komórek (300 µL) do jednego dołka 24-dołkowej płytki mikrotitracyjnej pokrytej kolagenem z naniesionym szkiełkiem nakrywkowym (wykorzystanym później jako kontrola transfekcji). Rozmieść komórki równomiernie i inkubuj w 37 °C.
   1. Po 24 h wymień pożywkę w naczyniu 10 cm na 10 mL świeżej pełnej pożywki DMEM. Nie wymieniaj pożywki w kontroli transfekcji. Inkubuj przez kolejne 6 dni w 37 °C.

3. Pozyskiwanie wewnątrz- i zewnątrzkomórkowego HEV pochodzącego z hodowli komórkowych (HEVcc)

1. Aby zebrać pozakomórkowy HEVcc (Rysunek 3), przefiltrować nadsącz uzyskany z szalki 10 cm po 6 dniach przez siatkę 0,45 µm w celu usunięcia resztek komórkowych. Zebrany pozakomórkowy HEVcc przechowywać w temperaturze 4 °C w przypadku infekcji w tym samym dniu; w przeciwnym razie przechowywać w -80 °C.
2. Aby zebrać wewnątrzkomórkowy HEVcc (Rysunek 3), przemyć komórki 1x PBS i poddać trypsynizacji poprzez dodanie 1,5 mL 0,05% trypsyny z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (trypsyna-EDTA). Inkubować w 37 °C do całkowitego oddzielenia komórek. Dodać 10 mL kompletnego DMEM, wypłukać szalkę, aby oddzielić komórki, i przenieść zawiesinę komórkową do probówki 50 mL. Przemyć komórki dwukrotnie PBS. Centryfugować przy 200 x g przez 5 min.
   1. Odlać nadsącz i resuspendować osad komórkowy w 1,6 mL kompletnego DMEM na jedną elektroporację. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki reakcyjnej 2 mL.
      UWAGA: Nie używać większych objętości, ponieważ drastycznie zmniejszyłoby to miano wirusa.
   2. Zamrozić (w ciekłym azocie) i rozmrozić komórki. Powtórzyć tę sekwencję 3 razy.
      UWAGA: Nie łączyć więcej niż jednej elektroporacji (1,6 mL) podczas 3 cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ obniżyłoby to wydajność lizy. Nie mieszać zawiesiny komórkowej w vorteksie pomiędzy cyklami. Należy upewnić się, że zawiesina komórkowa jest rozmrażana powoli (np. w temperaturze pokojowej lub na lodzie), aby zmaksymalizować miano wirusa.
   3. Zcentryfugować zlizowane komórki przy wysokiej prędkości przez 10 min przy 10 000 x g, aby oddzielić resztki komórkowe. Przenieść nadsącz do nowej probówki. Wykorzystać nadsącz do infekcji; w przeciwnym razie przechowywać w -80 °C.
   4. Opcjonalnie, skoncentrować pozakomórkowy i wewnątrzkomórkowy HEVcc przy użyciu koncentratora w celu zwiększenia miana wirusa.

Tabela 1: Tabela składu buforów.

Roztwór roboczy	Koncentracja	Objętość
Kolagen	40 mL	PBS
	40 µl	Kwas octowy
	1 ml	Sterylny roztwór kolagenu R 0,4%
Cytomix	120 mM	KCl
	0,15 mM	CaCl22
	10 mM	K2HPO4 (pH 7,4)
	25 mM	HEPES
	2 mM	EGTA
pełna pożywka DMEM	500 mL	DMEM
	5 ml	Pen/Strep
	5 ml	MEM NEAA (100X)
	5 ml	L-glutamina
	50 ml	Płodowa surowica bydlęca
pełna pożywka MEM	500 ml	MEM
	5 mL	pirowinian sodu
	5 mL	Gentamycyna
	5 mL	MEM NEAA (100X)
	5 ml	L-glutamina
	50 ml	ultra-niska zawartość IgG

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczny układ eksperymentalny przygotowania komórek HepG2 do produkcji wirusa zapalenia wątroby E pochodzenia hodowli komórkowej (HEVcc).

Rycina 2: Schematyczna konfiguracja eksperymentalna dla elektroporacji komórek HepG2.

Rysunek 3: Schematyczna konfiguracja eksperymentalna dla pozyskiwania wewnątrz- i zewnątrzkomórkowych HEVcc.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0.45 µm mesh	Sarstedt	83.1826	Zbiór wirusów pozakomórkowych
MEM	gibco	31095-029	Hodowla komórkowa
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	Hodowla komórkowa
Trypsin-EDTA (0.5 %)	gibco	15400054	Hodowla komórkowa
ultra-low IgG	gibco	1921005PJ	Hodowla komórkowa
Acetic acid	CarlRoth	6755.1	Roboczy roztwór kolagenu
ATP	Roche	11140965001	Transkrypcja in vitro i elektroporacja
BioRender	BioRender		Tworzenie schematów
Calcium chloride	Roth	5239.2	Cytomix
Collagen R solution 0.4 % sterile	Serva	47256.01	Roboczy roztwór kolagenu
DMEM	gibco	41965-039	Hodowla komórkowa
EGTA	Roth	3054.3	Cytomix
GenePulser Xcell Electroporation System	BioRad	1652660	Elektroporacja
HEPES	Invitrogen	15630-03	Cytomix
Di-potassium hydrogen phosphate	Roth	P749.1	Cytomix
KCL	Roth	6781.3	Cytomix
Potassium di-hydrogen phosphate	Roth	3904.2	Cytomix
L-Glutamin	gibco	25030081	Hodowla komórkowa
L-Glutathione reduced	Sigma-Aldrich	G4251-5G	Cytomix
MEM	gibco	31095-029	Hodowla komórkowa
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	Hodowla komórkowa
Magnesium chloride	Roth	2189.2	Cytomix
Microvolume UV-Vis spectrophotometer NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	Stężenie DNA/RNA
PBS	gibco	70011051	Hodowla komórkowa
Pen/Strep	Thermo Fisher	15140122	Hodowla komórkowa