Przeprogramowanie ludzkich komórek krwi w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste za pomocą wirusa Sendai

Streszczenie

Źródło: Rim, Y. A., et al. Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation. J. Vis. Exp. (2016).

Niniejszy film prezentuje generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSCs) z ludzkich mononuklearnych komórek krwi obwodowej z wykorzystaniem reprogramowania za pośrednictwem wirusa Sendai. Wirusowe czynniki transkrypcyjne aktywują sieci pluripotencji i supresują geny linii komórkowych, umożliwiając podzbiorowi komórek nabycie właściwości adhezyjnych i tworzenie kolonii iPSC. Protokół zapewnia wzbogacenie i utrzymanie tych reprogramowanych komórek poprzez selektywne wiązanie z macierzą oraz codzienną wymianę pożywki.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi IRB instytutu.

1. Transdukcja wirusem Sendai

1. Transdukcja (dzień 0)
   1. Zebrać i przenieść komórki krwi do probówki stożkowej o pojemności 15 ml, a następnie policzyć je za pomocą hemocytometru.
   2. Przygotować 3 x 10⁵ komórek na jedną transdukcję i odwirować je przy 515 x g przez 5 min w RT (temperaturze pokojowej).
   3. Usunąć supernatant za pomocą odsysacza i resuspenderć komórki w 0,5 ml pożywki do komórek krwi.
   4. Przenieść komórki do dołka niepowlekanej płytki 24-dołkowej.
   5. Rozmrozić mieszaninę wirusa Sendai na lodzie i dodać ją do zawiesiny komórkowej. Dodać wirusa Sendai do komórek zgodnie z zaleceniami producenta.
   6. Uszczelnić płytkę folią uszczelniającą i wirować przy 1 150 x g przez 30 min w temperaturze 30 °C.
   7. Po wirowaniu inkubować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez noc (O/N).
2. Przeniesienie komórek na macierz z komórkami karmnymi (dzień 1)
   1. Następnego dnia powlec płytkę 24-dołkową witronektyną. Rozcieńczyć roztwór witronektyny w PBS do końcowego stężenia 5 µg/ml. Dodać 1 ml witronektyny do dołka płytki 24-dołkowej i inkubować w RT przez co najmniej 1 h. Przed użyciem usunąć roztwór powlekający. Powleczone płytki można przechowywać w RT przez 3 dni.
   2. Przenieść całą pożywkę zawierającą komórki i wirusa do powleczonego dołka.
   3. Zebrać pozostałe komórki, dodając kolejne 0,5 ml świeżej pożywki do komórek krwi, i przenieść je do dołka z komórkami.
   4. Wirować płytkę przy 1 150 x g przez 10 min w temperaturze 35 °C.
   5. Po wirowaniu usunąć supernatant, dodać 1 ml pożywki dla iPSC i hodować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez noc (O/N).
3. Drugie przeniesienie komórek (dzień 2)
   1. Powlec dołki nowej płytki 24-dołkowej witronektyną w stężeniu 5 µg/ml, zgodnie z opisem w punkcie 1.2.1. Użyć jednego dołka płytki dla każdej transdukcji.
   2. Przenieść zawiesinę komórkową z pierwszej płytki na nową płytkę powleczoną witronektyną.
      UWAGA: Jeśli nie są potrzebne, komórki w zawiesinie można usunąć. Procedurę opisaną w punkcie 2.3 można powtórzyć 2-3 razy w odniesieniu do komórek w zawiesinie. W przypadku powtarzania tych kroków należy zebrać komórki.
   3. W międzyczasie dodać 1 ml pożywki dla iPSC (indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych) do dołka pierwszej płytki w celu ich utrzymania i inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez noc (O/N).
   4. Utrzymywać przytwierdzone komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂, dokonując codziennej wymiany pożywki na świeżą pożywkę dla iPSC. Kolonie pojawią się w dniach 14-21 po transdukcji.
   5. Wirować nowo powleczoną płytkę zawierającą zawiesinę komórkową przy 1 150 x g i 35 °C przez 10 min.
   6. Po wirowaniu inkubować komórki w temperaturze 37 °C w 5% CO₂ przez noc (O/N).
   7. Następnego dnia usunąć supernatant i zastąpić go świeżą pożywką dla iPSC.
      UWAGA: Procedurę opisaną w punkcie 1.3 można powtórzyć 2-3 razy w odniesieniu do komórek w zawiesinie. W przypadku powtarzania tych kroków należy zebrać komórki z supernatantu i powtórzyć punkt 1.3.
   8. Utrzymywać przytwierdzone komórki, dokonując codziennych wymian pożywki, aż do osiągnięcia 80% konfluencji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wyroby plastikowe
probówka stożkowa 50 ml	SPL	50050
probówka stożkowa 15 ml	SPL	50015
pipeta jednorazowa 10 ml	Falcon	7551
Jednorazowa pipeta 5 ml	Falcon	7543
płytka 12-dołkowa	TPP	92012
Płytka 24-dołkowa	TPP	92024
Materiały do generowania i hodowli iPSC
Zestaw do reprogramowania Sendai CytoTune-iPSC	Life Technologies	A16518
Pożywka TeSR-E8	STEMCELL Technologies	5940	pożywka do iPSC
Witronektyna	Life Technologies	A14700
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	Roztwór do odrywania kolonii