Analiza internalizacji wirusa grypy z wykorzystaniem testu blokowania streptawidyną

Streszczenie

Źródło: Pohl, M. O. & Stertz, S. Pomiar przywiązania i internalizacji wirusa grypy A w komórkach A549 za pomocą cytometrii przepływowej. J. Vis. Exp. (2015) Ten film demonstruje zastosowanie testu blokującego z użyciem streptawidyny w celu odróżnienia wirusa grypy związanego z powierzchnią komórki od wirusa zinternalizowanego w ludzkich komórkach nabłonkowych płuc. Porównanie sygnałów fluorescencji wykazuje, że wyższa intensywność po inkubacji wskazuje na skuteczną internalizację wirusa. Pohl, M. O. & Stertz, S. Pomiar przyłączania i internalizacji wirusa grypy typu A w komórkach A549 metodą cytometrii przepływowej. J. Vis. Exp. (2015)

Niniejszy film demonstruje zastosowanie testu blokowania streptawidyną w celu odróżnienia wirusa grypy związanego z powierzchnią komórki od wirusa zinternalizowanego w ludzkich komórkach nabłonkowych płuc. Porównanie sygnałów fluorescencji wykazuje, że wyższa intensywność po inkubacji świadczy o pomyślnej internalizacji wirusa.

Protokół

1. Test przyczepiania/internalizacji

UWAGA: Przed rozpoczęciem analizy należy przygotować wszystkie odczynniki. W przypadku trzech grup kontrolnych przedstawionych w sekcji wyników (komórek pozornie zakażonych, komórek wstępnie potraktowanych neuraminidazą oraz komórek potraktowanych azotkiem sodu) wymagane są niewielkie modyfikacje protokołu.

1. Przygotować 16 probówek typu deepwell, z których każda zawiera 20 0 komórek A549. Oprócz zestawu eksperymentalnego składającego się z 4 probówek, przewidziano 3 warunki kontrolne, z których każdy wymaga 4 probówek: komórki mock-infected, komórki wstępnie traktowane neuraminidazą (NA) oraz komórki traktowane azotkiem sodu. Każda grupa składa się z 4 probówek oznakowanych jako „0 min”, „0 min + streptawidyna (STV)”, „30 min”, „30 min + STV”.
2. Wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 min przy 450 x g. Usunąć supernatant i resuspender osad w 200 µl fosforanu buforu solnego (PBS).
3. Wirować probówki w temperaturze 4 °C przy 450 x g. Usunąć supernatant i resuspender osad w 20 µl zmodyfikowanej pożywki Eagle'a z dodatkiem Dulbecco (DMEM) zawierającej 0,3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 20 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) i 1% penicyliny-streptomycyny (pożywka inkubacyjna). Inkubować przez 30 min w 37 °C.
   UWAGA: Dla kontroli neuraminidazowej: do resuspensji komórek użyć bakteryjnej neuraminidazy (np. sjalidazy z Vibrio cholera) w stężeniu 20 mU/ml rozcieńczonej w pożywce inkubacyjnej.
4. Wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 min przy 450 x g. Usunąć supernatant i resuspender osad w 20 µl PBS. Powtórzyć ten krok jeszcze raz, a następnie chłodzić probówki na lodzie przez 10 min.
5. Wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 min przy 450 x g. Usunąć supernatant i resuspender osad w 10 µl biotynilowanego wirusa (użyć stężenia wirusa określonego w sekcji 2, rozcieńczonego w PBS do infekcji). Inkubować przez 1 h na lodzie.
6. Wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 min przy 450 x g. Usunąć supernatant i resuspender osad w 20 µl PBS. Powtórzyć ten krok jeszcze raz.
   UWAGA: Dla kontroli mock-infected: użyć PBS do infekcji bez wirusa. Dla kontroli z azotkiem sodu: użyć wirusa rozcieńczonego w PBS do infekcji z dodatkiem 0,1% azotku sodu.
7. Opracowanie próbek po infekcji na lodzie:
   1. Dla próbek „0 min” postępować zgodnie z krokiem 2.5 i przechowywać próbki w 4 °C do czasu utrwalenia pozostałych próbek.
   2. Dla próbek „0 min + STV” wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 min przy 450 x g. Usunąć supernatant i resuspender osady w 50 µl STV (użyć stężenia określonego w sekcji 3) rozcieńczonej w PBS zawierającym 2% BSA i 0,1% azotku sodu (aby zapobiec internalizacji podczas manipulowania próbką). Inkubować przez 30 min na lodzie.
   3. Wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 min przy 450 x g. Usunąć supernatant i resuspender osad w 20 µl PBS. Powtórzyć ten krok jeszcze raz.
   4. W celu utrwalenia wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 min przy 450 x g. Usunąć supernatant i resuspender osad w 10 µl 3,7% paraformaldehydu (PFA). Inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT). Następnie powtórzyć krok płukania opisany w punkcie 1.6) i przechowywać próbki w 4 °C.
   5. Dla próbek „30 min” wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 min przy 450 x g. Usunąć supernatant i resuspender osad w 20 µl PBS zawierającego 2% BSA. Inkubować przez 30 min w 37 °C. Postępować zgodnie z krokami 1.7.3-1.7.4 i przechowywać próbki w 4 °C.
      UWAGA: Dla kontroli z azotkiem sodu: do 30-minutowej inkubacji w 37 °C użyć PBS uzupełnionego o 2% BSA i 0,1% azotku sodu.
   6. Dla próbek „30 min + STV” wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 min przy 450 x g. Usunąć supernatant i resuspender osad w 20 µl PBS zawierającego 2% BSA. Inkubować przez 30 min w 37 °C. Następnie wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 min przy 450 x g. Usunąć supernatant i resuspender osady w 50 µl STV (użyć stężenia określonego w sekcji 3) rozcieńczonej w PBS zawierającym 2% BSA i 0,1% azotku sodu (aby zapobiec internalizacji podczas manipulowania próbką). Inkubować przez 30 min na lodzie. Postępować zgodnie z krokami 1.7.3-1.7.4 i przechowywać próbki w 4 °C.
      UWAGA: Dla kontroli z azotkiem sodu: do 30-minutowej inkubacji w 37 °C użyć PBS uzupełnionego o 2% BSA i 0,1% azotku sodu.
8. W celu permeabilizacji wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 min przy 450 x g. Usunąć supernatant i resuspender osad w 10 µl PBS zawierającego 0,5% Triton X-10. Inkubować przez 6 min w RT. Następnie powtórzyć krok płukania opisany w punkcie 1.6).
9. Wirować probówki w temperaturze 4 °C przez 3 min przy 450 x g. Usunąć supernatant i resuspender osad w 50 µl 2% BSA rozcieńczonego w PBS zawierającym STV-Cy3. (Uwaga: odpowiednie stężenie STV-Cy3 należy określić przed rozpoczęciem eksperymentu. Należy zacząć od stężenia 1:20 i przetestować rozcieńczenia dwukrotne do 1:2 40. W naszych badaniach optymalnym okazało się rozcieńczenie 1:1 0).
10. Inkubować przez 1 h w ciemności w RT. Następnie powtórzyć krok płukania opisany w punkcie 1.6, ale resuspender osad w 20 µl 2% BSA rozcieńczonego w PBS.
11. Próbki analizować metodą cytometrii przepływowej. Określić procent komórek Cy3-dodatnich w każdej próbce.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Life Technologies	4196-052
FBS	Life Technologies	10270-106
Penicylina-streptomycyna	Life Technologies	15140-163
PBS	Life Technologies	14190-169
BSA	VWR Calbiochem	126579
HEPES	Life Technologies	15630-10
D-Sacheroza	Fluka	8410
Bio Rad Protein Bio Assay	Bio Rad	50-006
Probówki typu deepwell (mikroprobówki 1.2 ml)	Milian	82 0 01
PFA	Lucerna chem Electron microscopy sciences	15710
Probówki do ultrawirowania	Hemotec HmbH	253070
Triton X-10	Fluka	93420
STV-Cy3	Life Technologies	43-4315
STV	Life Technologies	43-4302
Azydek sodu	Fluka	71290
Bakteryjna neuraminidaza/sjalidaza	Sigma-Aldrich	N6514-1UN