Ocena hamowania wzrostu bakterii przez bakteriofagi za pomocą pomiarów gęstości optycznej

Streszczenie

Źródło: Niu, Y. D., et al. Bacteriophage Effectiveness for Biocontrol of Foodborne Pathogens Evaluated via High-Throughput Settings. J. Vis. Exp. (2021)

W niniejszym filmie zaprezentowano test w płytce mikrotitracyjnej służący do oceny aktywności litycznej koktajli fagowych przeciwko kulturom bakteryjnym E.coli. Przedstawiono w nim, w jaki sposób zmiany gęstości optycznej pozwalają określić potencjał fagów oraz stężenie niezbędne do całkowitego zahamowania wzrostu bakterii

Protokół

1. Przygotowanie buforu i odczynników

1. Przygotować 50 mL bulionu sojowo-tryptycznego (TSB) (15 g proszku TSB i 50 mL wody ultrapurej) i poddać autoklawowaniu.
   UWAGA: Pożywkę tę można przechowywać w temperaturze pokojowej do 3 miesięcy lub w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.
2. Przygotować 50 mL agaru sojowo-tryptycznego (TSA) (20 g proszku TSA i 50 mL wody ultrapurej) i poddać autoklawowaniu.
   UWAGA: Pożywkę tę można przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.
3. Przygotować 50 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS; 4 g NaCl, 0,1 g KCl, 0,7 g Na₂HPO₄ oraz 0,12 g KH₂PO₄, 50 mL wody ultrapurej), zmierzyć i dostosować pH do 7,2 ± 0,2 w temperaturze 25 °C, a następnie poddać autoklawowaniu.
   UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.
4. Przygotować 20 mL 1 M MgSO₄ (49,294 g i 20 mL wody ultrapurej) i wysterylizować za pomocą filtra z polietersulfonu o rozmiarze oczek 0,2 µm.
5. Przygotować 50 mL TSB z dodatkiem 10 mM MgSO₄ (mTSB; 15 g proszku TSB, 50 mL wody ultrapurej i 5 mL 1 M MgSO₄) i poddać autoklawowaniu; pozostawić autoklawowaną pożywkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Stosować technikę aseptyczną. Używając pipety serologicznej, ostrożnie przenieść 5,0 mL 1 M MgSO₄; delikatnie zamieszać ruchem wirowym w celu wymieszania.

2. Przygotowanie hodowli bakteryjnej

1. Aby przygotować kulturę laboratoryjną bakterii (BRLC), należy wyjąć fiolki z zapasami w glicerolu z zamrażarki i przenieść je do laboratorium.
2. Używając jednorazowej pętli do szczepienia lub odpowiednika, zanurzyć ją w fiolce, pobrać niewielką ilość inokulum (zamrożonej zawiesiny) i wysiać na płytkę TSA lub odpowiednią w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II. Inkubować płytkę w temperaturze 37 ± 2 °C przez 15−18 h.
3. Przygotowane płytki BRLC zapakować do worków i przechowywać w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Ogólny okres ważności BRLC: 14 dni w temperaturze 4 °C od momentu przygotowania.
4. Pojedynczą kolonię każdego szczepu E. coli O157 z płytek BRLC przeznaczonych do badania zaszczepić w 10 mL TSB i inkubować statycznie w temperaturze 37 °C przez 18 h, aby osiągnąć stężenie 9 log10 CFU/mL.
5. Przygotować rozcieńczenia seryjne kultur nocnych (następnego dnia rano) dla każdego szczepu E. coli O157, używając mTSB zawierającego 10 mM MgSO₄, aby uzyskać stężenie 4-5 log10 CFU/ml (lub inny pożądany poziom inokulum).
6. W celu przygotowania mieszaniny bakteryjnej zmieszać równe objętości kultur nocnych każdego szczepu, aby uzyskać całkowite stężenie 4-5 log10 CFU/mL (lub według potrzeb).
7. Rozcieńczoną kulturę bakterii natychmiast umieścić w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
8. Kulturę inokulum rozcieńczyć 10- lub 10-krotnie, a następnie wysiać 0,1 mL alikwotów tych rozcieńczeń na płytki TSA w celu uzyskania izolowanych kolonii.

3. Przygotowanie roztworów roboczych fagów

1. Namnożyć wysokotytrowe zapasy robocze dla każdego bakteriofaga przeznaczonego do przesiewu (≥108 PFU/mL), stosując standardowe metody4.
   UWAGA: Ogólny okres ważności zapasów fagów po przygotowaniu wynosi 3 miesiące w plastikowej butelce w temperaturze 4 °C.
2. Aby uzyskać pożądany tytru, np. ~10⁸ PFU/mL do badania kinetyki lizy, rozcieńczyć poszczególne preparaty fagowe w mTSB zawierającym 10 mM MgSO₄. Przygotować koktajle fagowe, mieszając równe objętości każdego zapasu roboczego o tym samym tytrze we wszystkich możliwych kombinacjach.

4. Przygotowanie in vitro kinetyki lizy dla poszczególnych fagów oraz koktajli fagowych

1. W celu przygotowania testu na mikropłytce przygotuj seryjne rozcieńczenia dziesięciokrotne każdego faga w kolumnach 1-8 w sterylnych mikropłytkach 96-dołkowych.
   UWAGA: Na każdej płytce w sąsiednich kolumnach można przetestować w dubletach cztery fagi przeciwko jednemu szczepowi bakteryjnemu. Pozostałe cztery kolumny służą jako kontrole bez faga oraz kontrola ujemna mTSB (Ryc. 1).
2. Do dołków od kolumny 1 do 12 mikropłytki 96-dołkowej wlej 180 µL mTSB.
3. Do dołków 1-8 w górnym rzędzie mikropłytki (Rząd A) dodaj 20 µL rozcieńczonych poszczególnych fagów lub koktajli fagowych (~108 PFU/mL).
4. W przypadku kontroli bez faga oraz kontroli ujemnej (Blank), dodaj 20 µL mTSB do górnych dołków w kolumnach 9, 10 i 1.
5. Za pomocą pipety 12-kanałowej wykonaj rozcieńczenia na płytce. Przenieś 20 µL z rzędu na rząd. Dokładnie wymieszaj zawartość poprzez delikatne, powtarzane aspiracje i wydmuchnięcia (co najmniej pięciokrotnie), zmieniając końcówki pomiędzy rozcieńczeniami. Usuń 20 µL z ostatniego rzędu (Rząd H).
   UWAGA: Zaleca się stosowanie końcówek z filtrem, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej.
6. Przygotuj rezerwuar dla każdego szczepu. Użyj pipety 1 mL, aby przenieść 2-3 mL rozcieńczonej kultury do rezerwuaru. Dla kolumn 1-10 użyj pipety wielokanałowej, aby dodać 20 µL rozcieńczonej kultury bakteryjnej do każdego dołka. Zmieniaj końcówki po każdym dodaniu.
7. Przykryj i inkubuj mikropłytkę w wybranych warunkach (np. 37 °C przez 10 h lub 22 °C przez 2 h).
8. Po 2 h lub w innych wybranych odstępach czasu wyjmij mikropłytki z inkubatora.

Wyniki

Rysunek 1: Sugerowany układ testu na płytce 96-dołkowej. Seryjne rozcieńczenia 10-krotne każdego faga przygotowuje się w kolumnach 1-8 sterylnych płytek 96-dołkowych. Cztery fagi przeciwko jednemu szczepowi bakterii można testować w dubletach, w sąsiednich kolumnach na każdej płytce. Pozostałe kolumny służą jako kontrole.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Niezbędne materiały, odczynniki i sprzęt
Siarczan magnezu siedmiowodny	Sigma	1374361
Pipeta Pipet-Lite LTS L-10XLS+	METTLER TOLEDO	17014382
Pipeta Pipet-Lite LTS L-300XLS+	METTLER TOLEDO	17014405
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+	METTLER TOLEDO	17013808
Pipeta Pipet-Lite, Unv. SL-20XLS+	METTLER TOLEDO	17014412
Końcówki do pipet RT LTS 1000µL FL 768A/8-low retention	METTLER TOLEDO	30389213
Końcówki do pipet SR LTS 20µL F 960A/5	METTLER TOLEDO	17005860
Zbiornik	METTLER TOLEDO	89094-662
Sterylne, przezroczyste, polistyrenowe mikropłytki 96-dołkowe z płaskim dnem i pokrywkami	Fisher	168055
Agar sojowy z tryptonem (TSA)	Sigma	105458-0500
Bulion sojowo-kazeinowy (TSB)	Sigma	105459-0500
Rozprowadzacze do komórek w kształcie litery T	VWR	76299-566
Przyrządy
Kompaktowe inkubatory mikrobiologiczne	Fisher	5012590H
Wielokątne mieszadła magnetyczne	Fisher	14-512-125	długość: 20 mm
Hybrydowy wielofunkcyjny czytnik mikropłytek Synergy Neo2	Fisher	BTNEO2M
Oprogramowanie
SAS	SAS Institute	9.4