Znakowanie replikujących się genomów HSV-1 analogiem nukleozydowym

Streszczenie

Źródło: Dembowski, J. A., Deluca, N. A. Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins. J. Vis. Exp. (2017)

W niniejszym filmie przedstawiono zakażanie komórek ssaków w fazie stacjonarnej wirusem HSV-1 (Herpes Simplex Virus-1), a następnie replikację genomu wirusowego przy użyciu aparatu replikacyjnego gospodarza i wirusa. Syntetyczny analog nukleozydu zostaje wbudowany w nowo syntetyzowane wirusowe DNA w celu oznakowania replikujących się genomów, które są następnie izolowane do analizy proteomicznej powiązanych białek gospodarza i wirusa.

Protokół

1. Hodowla komórek, infekcja wirusowa i znakowanie EdC (5-etynylo-2′-deoksycytydyną) (Rysunek 1)

Poniższy protokół obejmuje pracę z wirusami. Prosimy o zapoznanie się z protokołami bezpieczeństwa biologicznego właściwymi dla Państwa instytucji w zakresie bezpiecznego obchodzenia się z wirusami i innymi czynnikami biologicznymi. Protokół ten został zatwierdzony przez Institutional Review Board Uniwersytetu w Pittsburghu.

1. Potraktuj trypsyną konfluentną hodowlę komórek MRC-5 (Medical Research Council cell strain 5) w kolbie hodowlanej 150 cm² i przenieś komórki na płytkę hodowlaną 60 cm2 zawierającą 10 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) z dodatkiem 10% FBS. Inkubuj w 37 °C w obecności 5% CO₂ przez 3 - 4 dni, aż komórki osiągną konfluencję i fazę stacjonarną. Konfluentna płytka 60 cm2 zawiera ~7 x 10⁷ komórek. Przygotuj jedną płytkę dla każdego wariantu doświadczalnego oraz jedną płytkę dla każdej odpowiadającej kontroli negatywnej.
   UWAGA: Komórki muszą osiągnąć fazę stacjonarną, aby zahamować replikację komórkowego DNA, co zapewni, że w kolejnych etapach znakowane i oczyszczane będzie wyłącznie vDNA (DNA wirusowe).
   UWAGA: Każda próbka wymaga uzupełniającej, nieznakowanej kontroli negatywnej, przygotowanej w tych samych warunkach infekcji i w tym samym punkcie czasowym, ale bez dodatku EdC.
   UWAGA: Równolegle należy przeprowadzić wersję tego eksperymentu w mniejszej skali, aby sprawdzić znakowanie komórkowego DNA za pomocą obrazowania, stosując porównywalne warunki wzrostu komórek, infekcji i znakowania EdC oraz te same punkty czasowe (patrz Krok 2).
2. Rozcieńcz 7 x 10⁸ PFU (plaque-forming units) HSV-1 w 7 mL zimnego roztworu TBS (Tris-Buffered Saline). Usuń pożywkę wzrostową i przechowuj w 37 °C. Aby przeprowadzić infekcję, dodaj 7 mL rozcieńczonego wirusa do komórek MRC-5 i kołysz przez 1 h w temperaturze pokojowej. Po adsorpcji usuń inokulum, przemyj 50 mL TBS w temperaturze pokojowej i przywróć pierwotną pożywkę wzrostową. Inkubuj w 37 °C w obecności 5% CO₂. Krok ten należy powtórzyć dla każdego wariantu doświadczalnego i kontroli negatywnej.
   UWAGA: Zwiększone znakowanie EdC można uzyskać, stosując mutanty HSV-1 z defektem ekspresji wirusowej dUTPazy (gen UL50) i/lub uracyloglikozydazy (gen UL2). dUTPaza HSV-1 wykazuje niską specyficzność substratową i może zmniejszać aktywację wielu analogów nukleozydów.
3. Znakuj genomy wirusowe za pomocą EdC. Postępuj zgodnie z instrukcjami w celu znakowania genomów wchodzących (1.3.1.), genomów replikujących się (1.3.2.) lub wirusowych widełek replikacyjnych (1.3.3.).
   UWAGA: W zależności od tego, czy w kolejnych etapach analizowane mają być genomy wchodzące, genomy zreplikowane czy widełki replikacyjne, należy wykonać odpowiednio tylko Krok 1.3.1, 1.3.2 lub 1.3.3.
   UWAGA: EdC można zastąpić EdU lub f-ara EdU. Należy monitorować i minimalizować toksyczność analogów nukleozydów.
   1. Użyj wcześniej znakowanych zapasów do przeprowadzenia infekcji w Kroku 1.2 i przejdź do Kroku 2 lub 3 w ciągu 4 h po infekcji (hpi), aby zbadać niezreplikowany vDNA (Rysunek 1A).
      UWAGA: Przygotuj wcześniej znakowane zapasy wirusa zgodnie z opisanym wcześniej protokołem 25. Zapasy wirusa muszą zostać przepuszczone przez kolumnę G-25, aby usunąć resztkowe EdC.
   2. Znakuj replikujący się vDNA, dodając 5 - 25 µM EdC do pożywki hodowlanej zainfekowanych komórek na 2 - 4 h (Rysunek 1B). Przed dodaniem rozcieńcz EdC w 1 mL pożywki wzrostowej.
   3. Aby znakować wirusowe widełki replikacyjne, po rozpoczęciu replikacji vDNA (≥4 hpi) przeprowadź krótkie znakowanie (pulse) replikującego się vDNA za pomocą 5 - 25 µM EdC przez 5-20 min. W celu przeprowadzenia etapu wypłukiwania (chase), przemyj 3x pożywką do wypłukiwania zawierającą 25 - 10 µM 2´deoksycytydyny (deoxyC), a następnie inkubuj w pożywce do wypłukiwania przez dodatkowe 20-40 min (Rysunek 1C).
      UWAGA: Pożywka do etapu pulse i chase powinna zostać wyrównana do 37 °C i 5% CO₂ przed użyciem.
      UWAGA: W eksperymentach typu pulse-chase ważne jest uwzględnienie czasu potrzebnego na wniknięcie nukleozydów do komórki i ich fosforylację przed wbudowaniem w replikujący się DNA. Musi to zostać określone empirycznie.
      UWAGA: Aby określić rozdzielczość eksperymentów pulse-chase, oblicz tempo replikacji wirusa w zastosowanych warunkach doświadczalnych. Można to ustalić za pomocą ilościowego PCR genomów wirusowych podczas jednokrokowej krzywej wzrostu.

Wyniki

Rycina 1: Metody znakowania DNA HSV-1. (A) Aby zbadać stan wnikającego wirusa, komórki MRC-5 w fazie G0 są zakażane wcześniej oznakowanym HSV-1, a genomy są analizowane w czasie krótszym niż 4 hpi w celu zbadania niezreplik...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
komórki MRC-5	ATCC	CCL-171
Surowica z płodu bydlęcego (FBS)	Gibco	26140-179
podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	12800-082	Uzupełnione o 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 12 mM (dla hodowli w kolbach) lub 30 mM (dla hodowli w płytkach) wodorowęglanu sodu
60 cm²² szalka do hodowli tkankowych	Thermo Fisher Scientific	166508
Sól buforowana Trisem (TBS), pH 7,4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM tricyny
stok HSV-1			Najlepsze efekty dają zapasy o mianach przekraczających 1x10⁹ PFU/ml
5'-etynylo-2'-deoksycytydyna (EdC)	Sigma-Aldrich	T51307	Rozpuścić w DMSO w celu przygotowania roztworu zapasu o stężeniu 40 mM, podzielić na aalikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C
Inkubator do hodowli komórkowych
Dygestorium z laminarnym przepływem powietrza
Bloki grzejne			65 °C i 95 °C