Izolacja białek z kompleksów DNA wirusowego z białkami

Streszczenie

Źródło: Dembowski, J. A., et al. Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins. J. Vis. Exp. (2017).

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano izolację kompleksów białko–wirusowe DNA z jąder komórkowych z wykorzystaniem chemii klik i oczyszczania za pomocą kulek magnetycznych. Protokół obejmuje znakowanie genomów wirusowych nukleotydami zmodyfikowanymi alkinią, biotynylację poprzez reakcję klik oraz wiązanie do kulek magnetycznych powlekanych streptawidyną. Po przemyciu i elucji termicznej oczyszczone kompleksy są zbierane, gwałtownie zamrażane i przechowywane do dalszych analiz.

Protokół

1. Oczyszczanie vDNA i białek stowarzyszonych

UWAGA: Wszystkie bufory i odczynniki należy schłodzić na lodzie przed użyciem, a wszystkie etapy należy przeprowadzać na lodzie, chyba że wskazano inaczej.

1. Zbiór jąder komórkowych. UWAGA: Przed izolacją jąder można zastosować formaldehyd w celu sieciowania białek z DNA. Wówczas podczas oczyszczania DNA na kuleczkach pokrytych streptawidyną można zastosować bardziej rygorystyczne warunki przemywania.
   1. Zastąpić pożywkę wzrostową 20 mL buforu do ekstrakcji jąder (NEB) i inkubować przez 20 min w 4 °C przy sporadycznym kołysaniu. Jądra staną się widoczne pod mikroskopem.
   2. Zeskrobać jądra z płytki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść do probówki stożkowej o pojemności 50 mL. Wirować przez 10 min przy 2 500 x g w 4 °C w celu osadzenia jąder, a następnie odrzucić nadsącz.
      UWAGA: Do weryfikacji izolacji jąder z komórek można zastosować barwienie błękitem trypanu.
   3. Delikatnie zawiesić osad jądrowy w 10 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), przenieść do probówki stożkowej o pojemności 15 mL i osadzić poprzez wirowanie przez 10 min przy 2 500 x g w 4 °C. Całkowicie usunąć PBS.
      UWAGA: Jądra można zamrozić, a protokół można w tym punkcie przerwać. Aby to zrobić, delikatnie resuspendować osad jądrowy w 500 µL buforu do zamrażania i inkubować probówkę w kąpieli z etanolu i suchego lodu. Zamrożone jądra przechowywać w -80 °C. Przed użyciem rozmrozić jądra w temperaturze pokojowej, szybko przenieść na lód, dodać 10 mL PBS, delikatnie kołysać w celu wymieszania, osadzić przez wirowanie przez 10 min przy 2 500 x g w 4 °C i całkowicie usunąć PBS. Zamrażanie jąder może skutkować zmniejszoną wydajnością.
2. Kowalencyjne sprzęganie biotyny-azydku z DNA wirusowym (vDNA) znakowanym 5-etynyl-2′-deoksycytydyną (EdC).
   1. Resuspendować osad jądrowy w 10 mL mieszaniny do reakcji click [patrz Tabela materiałów], delikatnie pipetując w górę i w dół 5 razy pipetą 10 mL.
      UWAGA: Ważne jest, aby odczynniki wchodzące w skład mieszaniny do reakcji click dodawać w indicated kolejności.
   2. Rotować przez 1 h w 4 °C. Podczas rotacji przygotować i schłodzić bufory B1, B2 i B3 [patrz Tabela materiałów].
   3. Osadzić jądra poprzez wirowanie przez 10 min przy 2 500 x g w 4 °C. Całkowicie usunąć mieszaninę do reakcji click i przemyć osad, delikatnie resuspendując go w 10 mL PBS i wirować przez 10 min przy 2 500 x g w 4 °C.
   4. Delikatnie resuspendować osad jądrowy w 1 mL PBS i przenieść do probówki do mikrowirowania o pojemności 1,5 mL, używając końcówki do pipety o dużej średnicy. Osadzić jądra poprzez wirowanie przez 10 min przy 2 500 x g w 4 °C. Całkowicie usunąć PBS i błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie.
      UWAGA: Protokół można w tym punkcie przerwać, a zamrożone jądra przechowywać w -80 °C. Cykl zamrażania i rozmrażania ułatwia późniejszą lizę, dlatego zaleca się błyskawiczne zamrażanie jąder nawet w przypadku przejścia do kroku 1.3 w tym samym dniu.
3. Liza jąder i fragmentacja DNA.
   1. Rozmrozić jądra na lodzie i resuspendować w 500 µL buforu B1 poprzez pipetowanie w górę i w dół. Inkubować na lodzie przez 45 min.
   2. Sonicować próbki 6 razy po 30 s każda przy amplitudzie 40% przy użyciu sondy z mikrokońcówką 3 mm. Umieszczać próbki na lodzie przez 30 s pomiędzy impulsami. Po sonikacji próbki powinny być klarowne, a nie mętne.
      UWAGA: Warunki sonikacji należy zoptymalizować dla poszczególnych sonikatorów.
   3. Osadzić szczątki komórkowe poprzez wirowanie przy 14 000 x g przez 10 min w 4 °C. Wielkość osadu powinna ulec znacznemu zmniejszeniu. Przefiltrować nadsącz przez sitko komórkowe 100 µM i zachować przefiltrowaną ciecz.
   4. Dodać 500 µL buforu B2 do przefiltrowanego nadsączu. 900 µL tej próbki zostanie wykorzystanych w kroku 1.4.2.
   5. Pobrać alikwot z każdego wariantu do izolacji DNA (50 µL lub 1/20 objętości) i dodać 50 µL 2x roztworu SDS-bikarbonianowego [patrz Tabela materiałów]. Przejść do protokołu izolacji DNA.
   6. Pobrać alikwot z każdego wariantu dla białka wejściowego (50 µL lub 1/20 objętości) i dodać 50 µL 2x buforu do próbek Laemmli, zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w -80 °C.
4. Wiązanie biotynilowanego DNA z kuleczkami pokrytymi streptawidyną.
   1. Przygotować magnetyczne kuleczki Streptavidin T1, przenosząc 300 µL zawiesiny kuleczek do probówki do mikrowirowania 1,5 mL. Przygotować jedną probówkę kuleczek na próbkę. Przemyć kuleczki 3x 1 mL buforu B2, resuspendując je za pomocą wortexowania, oddzielając kuleczki magnesem i odsysając bufor do przemywania.
      UWAGA: Zoptymalizowane warunki wiązania pozwalają na maksymalizację wydajności i minimalizację wiązania nieswoistego. Doświadczalnie ustalono, że magnetyczne kuleczki Streptavidin T1 mają znacznie większą pojemność wiązania niż kuleczki agarozowe oraz inne kuleczki Streptavidin, a mniejsze wiązanie nieswoiste niż kuleczki Streptavidin C1 (Rycina 1A).
   2. Dodać 900 µL próbki z kroku 1.3.4. do przemytych kuleczek i rotować przez noc w 4 °C.
      Uwaga: Nie wortexować kuleczek po dodaniu do nich próbki.
      UWAGA: Jeśli w nieznakowanej kontroli negatywnej zostaną wyizolowane znaczące ilości DNA lub białka, ten krok można skrócić z całej nocy do 4 h, aby zmniejszyć wiązanie nieswoiste.
5. Przemywanie kuleczek i elucja vDNA oraz związanych białek.
   UWAGA: W pozostałych krokach zaleca się stosowanie końcówek z filtrem.
   1. Umieścić próbki w magnetycznym statywie do probówek do mikrowirowania, usunąć nadsącz, delikatnie resuspendować w 1 mL buforu B2 i rotować w 4 °C przez 5 min.
   2. Powtórzyć krok 1.5.1 trzy razy.
   3. Umieścić próbki w magnetycznym statywie do probówek do mikrowirowania, usunąć nadsącz, delikatnie resuspendować w 1 mL buforu B3 i rotować w 4 °C przez 5 min.
   4. Przenieść 100 µL mieszaniny kuleczek (1/10 objętości) do nowej probówki w celu izolacji związanego DNA. Przyłożyć probówkę do magnesu, usunąć nadsącz, resuspendować kuleczki w 100 µL 1x roztworu SDS lub SDS-bikarbonianowego i przejść do protokołu izolacji DNA.
   5. Przyłożyć probówkę zawierającą pozostałe 900 µL mieszaniny kuleczek z kroku 1.5.3. do magnesu, usunąć nadsącz i resuspendować kuleczki w 50 µL 2x buforu do próbek Laemmli, aby eluować białko i kompleksy DNA-białko.
   6. Gotować próbki w 95 °C przez 15 min, wortexować, szybko wirować w mikrowirowarce i przyłożyć magnes. Przenieść eluat do nowej probówki, błyskawicznie zamrozić i przechowywać w -80 °C.
      UWAGA: Użyć zabezpieczeń zakrętek, aby upewnić się, że probówki nie otworzą się podczas gotowania.
      UWAGA: Protokół można w tym punkcie przerwać, a próbki można przechowywać w -80 °C przez kilka tygodni.
   7. Próbki białek analizować poprzez barwienie błękitem Coomassie, western blotting lub spektrometrię mas zgodnie ze standardowymi procedurami. Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Ryciniach 1 i 2.
      UWAGA: Aby określić, czy wydajność białka jest wystarczająca do spektrometrii mas, 7,5 µL każdej próbki wykorzystuje się do analizy barwieniem błękitem Coomassie, a 7,5 µL do western blottingu reprezentatywnego białka związanego z genomem wirusowym (ICP4, ICP8 lub UL42). Równolegle nanosi się taką samą objętość lizatów z kroku 1.3.6. w celu kontroli poziomów białka wejściowego. Pozostałą część próbki (35 µL) analizuje się następnie za pomocą spektrometrii mas.

Wyniki

Rysunek 1: Reprezentatywne wyniki oczyszczania białek. (A) Porównanie wydajności białka w zależności od zastosowania kilku różnych typów kulek pokrytych streptawidyną podczas etapów oczyszczania. Infekcję przeprowadzono w obecności EdC (+) w celu porównania wydajności białka lub w jego nieobecności (-) w celu porównania wiązania niespecyficznego. Przeprowadzono infekcje oraz znakowanie EdC, a kompleksy DNA-białko oczyszczono przy użyciu porównywalnych ilości różnych typów kulek pokrytych streptawidyną. Górny panel: Porównanie wydajności białka po oczyszczaniu na kuleczkach agarozowych pokrytych streptawidyną lub Streptavidin M-280. Dolny panel: Porównanie wydajności białka po oczyszczaniu na Streptavidin M-270, M-280, Streptavidin C1 lub Streptavidin T1. Western blotting przeprowadzono z użyciem przeciwciała przeciwko wirusowemu białku ICP4. W pierwszej ścieżce, dla porównania, pokazano oczyszczone ICP4. Aby zaobserwować w dolnym panelu podobną intensywność ICP4 w ścieżce "280" jak w panelu górnym, wymagany był dłuższy czas ekspozycji. (B) Przedstawiono reprezentatywne wyniki oczyszczania białek w funkcji czasu znakowania EdC. Przeprowadzono infekcje oraz znakowanie EdC, a kompleksy DNA-białko oczyszczono przy użyciu kulek Streptavidin T1. Znakowanie EdC trwało 0, 20, 40 lub 60 min; pokazano wyniki barwienia Coomassie Blue (góra) oraz western blottingu (dół). Western blotting przeprowadzono z użyciem przeciwciał specyficznych dla ICP4, UL42 lub GAPDH. Próbkę eluatu pobrano z kroku 1.5.5., a lizat z kroku 1.3.6. Strzałka wskazuje streptawidynę, natomiast L oznacza drabinę białkową.

Rysunek 2: Przykłady różnych sposobów prezentacji danych proteomicznych. (A) Wykresy kołowe podsumowują białka zidentyfikowane za pomocą spektrometrii mas eluatów białkowych związanych z genomami wirusowymi oczyszczonymi w 6 hpi. Wartości wskazują liczbę białek zidentyfikowanych dla każdej kategorii funkcjonalnej. T oznacza całkowitą liczbę zidentyfikowanych białek. Kolory oznaczają następujące kategorie: fioletowy – przetwarzanie RNA, czerwony – transkrypcja, zielony – przebudowa chromatyny, pomarańczowy – replikacja DNA, żółty – transport jądrowy, turkusowy – cytoszkielet, ciemnoniebieski – białka strukturalne HSV i szary – inne/nieznane. (B) Diagramy Venna przedstawiają nakładanie się białek zidentyfikowanych jako związane z genomami wirusowymi w 6, 8 lub 12 hpi. (C) Mapa STRING przedstawia białka wzbogacone w wirusowych widełkach replikacyjnych po 5-minutowym impulsie EdC. Białka ludzkie wzbogacone 5-krotnie w porównaniu z nieznakowaną kontrolą negatywną są pokazane na mapie oddziaływań funkcjonalnych, która została wygenerowana za pomocą STRING z ustawieniami danych wyświetlającymi tylko oddziaływania o wysokim stopniu pewności. Do mapowania oddziaływań wykorzystano nazwy genów. Okręgi wskazują białka uczestniczące w tym samym procesie biologicznym.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
komórki MRC-5	ATCC	CCL-171
płodowa surowica bydlęca (FBS)	Gibco	26140-179
podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	12800-082	uzupełnione o 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 12 mM (dla hodowli w kolbach) lub 30 mM (dla hodowli w szalkach) wodorowęglanu sodu
szalka do hodowli tkankowej 600 cm²	Thermo Fisher Scientific	166508
bufor solny Tris (TBS), pH 7.4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25.1 mM tricyny
stok HSV-1			najlepiej sprawdzają się stoki o mianie przekraczającym 1x10⁹ PFU/mL
kolumna Sephadex G-25 (kolumna odsalająca PD-10)	GE Healthcare	17085101
dimetylosulfotlenek (DMSO)	Fisher Scientific	D128-1
5´-etynyl-2´-deoksycytydyna (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	rozpuścić w DMSO w celu przygotowania stoku 40 mM, rozdzielić na alikwoty i przechowywać w -20 °C
2´-deoksycytydyna (deoxyC)	Sigma-Aldrich	D3897	rozpuścić w wodzie w celu przygotowania stoku 40 mM, rozdzielić na alikwoty i przechowywać w -20 °C
bufor do ekstrakcji jąder (NEB)			przygotować na świeżo (20 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl₂, 300 mM sacharozy, 0.5% Igepal)
skrobaczka do komórek	Bellco glass	7731-22000	autoklawować przed użyciem
roztwór błękitu trypanu	Sigma-Aldrich	T8154
PBS, pH 7.2 (10x)			1.37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na₂HPO₄, 18 mM KH₂PO₄ (przed użyciem rozcieńczyć do 1x w sterylnej wodzie)
siarczan(II) miedzi(II) pięciowodny (CuSO₄·5H₂O)	Fisher Scientific	C489	przygotować stok 100 mM i przechowywać w 4 °C do 1 miesiąca
(+) L-askorbinian sodu	Sigma-Aldrich	A4034	przygotować na świeżo stok 100 mM i przechowywać w lodzie do czasu użycia
azydk biotyny	Invitrogen	B10184	przygotować stok 10 mM w DMSO, rozdzielić na alikwoty i przechowywać w -20 °C do 1 roku
mieszanina do reakcji click			przygotować bezpośrednio przed użyciem, dodając odczynniki w indicated kolejności (10 mL: 8.8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO₄, 25mL 10 mM azydku biotyny, 1 mL 100 mM askorbinianu sodu)
kompletny koktajl inhibitorów proteaz	Roche	11697498001	rozpuścić w 1 mL wody w celu przygotowania stoku 50x, można przechowywać w 4 °C do 1 tygodnia lub bezpośrednio dodać 1 tabletkę do 50 mL buforu
bufor do zamrażania			przygotować na świeżo (7 mL 100% glicerolu, 3 mL NEB, 200 μL inhibitora proteaz 50x)
bufor B1			przygotować na świeżo (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x inhibitor proteaz)
bufor B2			przygotować na świeżo (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0.5% Igepal, 1x inhibitor proteaz)
bufor B3			przygotować na świeżo (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x inhibitor proteaz)
procesor ultradźwiękowy Vibra Cell Ultra wyposażony w mikroprotkę 3 mm	Sonics	VCX 130
sito do komórek	Falcon	352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Life Technologies	65601
magnes DynaMag-2	Life Technologies	12321D
rotator do mini-probówek	Fisher Scientific	260750F
2x bufor do próbek Laemmli			zmieszać 400 mg SDS, 2 mL 100% glicerolu, 1.25 mL 1 M Tris (pH 6.8) oraz 10 mg błękitu bromofenolowego w 8 mL wody. Przechowywać w 4 °C do 6 miesięcy. Przed użyciem dodać DTT 1 M do stężenia końcowego 200 mM.
blokady nakrętek do probówek 1.5 mL	Fisher Scientific	NC9679153
standardowe odczynniki do western blottingu
zestaw do barwienia koloidalnego NOVEX Colloidal Blue Staining Kit	Invitrogen	LC6025
12-dołkowa szalka do hodowli tkankowej	Corning	3513
szkiełka nakrywkowe	Fisher Scientific	12-545-100	autoklawować przed użyciem
szkiełka mikroskopowe	Fisher Scientific	12-552-5
16% paraformaldehyd	Electron Microscopy Sciences	15710	przed użyciem rozcieńczyć do 3.7% w 1x PBS
albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Fisher Scientific	BP1605	przygotować 3% w 1x PBS
bufor do permeabilizacji (0.5% Triton-X 100)	Sigma-Aldrich	T8787	przygotować 0.5% Triton-X 100 w 1x PBS
koktajl do reakcji click - zestaw obrazowania Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit	Molecular Probes	C10337	przygotować zgodnie z protokołem producenta
2x roztwór SDS-wodorowęglanu			2% SDS, 200 mM NaHCO₃
10x Tris EDTA (TE), pH 8.0			100 mM Tris, 10 mM EDTA (przed użyciem rozcieńczyć do 1x)
mikrowirówka do probówek 1.5 mL
wirówka stołowa do probówek 15 i 50 mL
inkubator do hodowli komórkowych
komora z laminarnym przepływem powietrza
bloki grzejne			65 °C i 95 °C