Pomiar reakcji okołodobowych i ostrych na światło u myszy z wykorzystaniem aktywności w kołowrotku

Podsumowanie

W niniejszym artykule omówiono metody, które można wykorzystać do określenia funkcji okołodobowej oraz reaktywności na światło u myszy.

Streszczenie

Rytmy okołodobowe to funkcje fizjologiczne, które cyklicznie powtarzają się w okresie około 24 godzin (circadian – circa: około i diem: dzień)^{1, 2}. Odpowiadają one za regulację cykli snu i czuwania oraz wydzielanie hormonów. Ponieważ czas trwania tych cykli nie wynosi dokładnie 24 godzin, są one synchronizowane z dniem słonecznym za pomocą bodźców świetlnych. Odbywa się to poprzez przekazywanie sygnałów świetlnych z siatkówki do jądra nadskrzyżowaniowego (SCN), które pełni rolę głównego rozrusznika synchronizującego zegary obwodowe w innych obszarach mózgu i tkankach obwodowych z środowiskowym cyklem światła i ciemności^3-7. Dostosowanie rytmów do tego środowiskowego cyklu światła i ciemności organizuje konkretne zdarzenia fizjologiczne w odpowiedniej niszy czasowej, co jest kluczowe dla przetrwania⁸. Na przykład myszy śpią w dzień i są aktywne w nocy. Zdolność do konsolidacji aktywności w jasnej lub ciemnej części doby nazywana jest fotoentrainmentem okołodobowym i wymaga dopływu światła do zegara okołodobowego⁹. Nocna aktywność myszy jest bardzo wyraźna, szczególnie w obecności kołowrotka. Pomiar tego zachowania jest małoinwazyjną metodą, którą można wykorzystać do oceny funkcjonalności systemu okołodobowego oraz dopływu światła do tego systemu. Metody omówione w niniejszym materiale służą do badania zegara okołodobowego, dopływu światła do tego systemu, a także bezpośredniego wpływu światła na zachowanie związane z bieganiem w kołowrotku.

Protokół

1. Przygotowanie aparatury

1. Przygotowanie grup zwierząt jest bardzo istotne podczas planowania każdego eksperymentu behawioralnego. W przypadku badania aktywności biegania w kołowrotku wszystkie myszy muszą być samcami, w tym samym wieku i, jeśli to możliwe, pochodzić z kojarzeń rodzeństwa. Do badania aktywności biegania w kołowrotku idealnie nadają się młodsze myszy, w wieku około 3 miesięcy.
2. Przed umieszczeniem zwierząt w kołowrotkach należy całkowicie przygotować pomieszczenie. Obejmuje to wyposażenie każdej klatki w 1 kołowrotek, 1 sondę obrotów kołowrotka, niewielką ilość ściółki dla myszy na dnie każdej klatki oraz wystarczającą ilość pokarmu i wody na 2 tygodnie.
3. Oświetlenie pomieszczenia jest niezwykle ważne; podczas przygotowywania klatek do biegania w kołowrotku należy zmierzyć natężenie światła przy każdej klatce, aby upewnić się, że oświetlenie w każdej z nich jest równomierne. Ponadto, wybierając źródło światła, należy szukać takiego o szerokim spektrum obejmującym zakres 450nm- 650nm. Wiele firm oferuje świetlówki typu „światło dzienne” lub „pełne spektrum”, które spełniają to kryterium. (Patrz Rysunek 1)

2. Konfiguracja eksperymentu

1. Podczas wprowadzania myszy do klatek z kołowrotkami należy robić to w cyklu oświetlenia, który ściśle odpowiada cyklowi światło/ciemność, w jakim zwierzęta były wcześniej utrzymywane.
2. Należy starać się równomiernie rozmieścić myszy, aby zapewnić podobne warunki środowiskowe dla wszystkich grup. Na przykład należy unikać grupowania wszystkich myszy z jednej grupy w konkretnym obszarze, np. na jednej półce. Mogłoby to nieumyślnie wprowadzić dodatkową zmienną.
3. Przed wprowadzeniem jakichkolwiek zaburzeń cyklu oświetlenia lub pomiarem aktywności, należy dać myszom około jednego tygodnia na aklimatyzację w nowej klatce i przy kołowrotku. Każda mysz, która po tygodniu nie korzysta z kołowrotka, powinna zostać usunięta z klatki i zastąpiona innym zwierzęciem.
4. Po uzyskaniu kohorty zwierząt stabilnie biegających na kołowrotkach można przystąpić do konfiguracji cykli światło/ciemność w celu przetestowania różnych hipotez. Różne cykle oświetlenia są szczegółowo omówione w części 3.

3. Analizy eksperymentalne

1. Aby zbadać fotoentrainment, należy rozpocząć od utrzymywania myszy w cyklu 12 h światła : 12 h ciemności. Przykładem takiego cyklu jest zapalenie światła od 7:00 do 19:00 i jego wygaszenie od 19:00 do 7:00. Ponadto zmniejszenie natężenia światła w 12-godzinnej fazie jasnej pozwoli ujawnić wszelkie różnice w wrażliwości na światło podczas procesu fotoentrainmentu. Myszy powinny mieć dwie tygodnie na fotoentrainment przed zmianą natężenia światła. (Rycina 2)
2. Dodatkowym aspektem fotoentrainmentu jest zdolność do ponownego dostrojenia lub re-entrainmentu rytmów okołodobowych do nowego cyklu światło/ciemność. Można to zbadać poprzez przyspieszenie cyklu światło/ciemność, w którym przebywają myszy, tak aby światło zapalało się i gasło wcześniej. Zazwyczaj cykle światła są przyspieszane o 6 godzin; na przykład zamiast cyklu od 7:00 do 19:00, stosuje się cykl od 1:00 do 13:00. Można to również zbadać poprzez opóźnienie cyklu świetlnego. Myszy są zazwyczaj w stanie przeprowadzić re-entrainment w ciągu 5-7 dni. (Rycina 3)
3. Paradygmaty te nie oceniają jednak w pełni funkcjonalności endogennego zegara okołodobowego. Utrzymywanie myszy w warunkach stałej ciemności może służyć do pomiaru endogennego okresu okołodobowego, znanego również jako okres wolnobieżny. U zwierząt nocnych, takich jak myszy typu dzikiego, okres endogenny jest krótszy niż 24 godziny, co oznacza, że każdego dnia zaczynają biegać w kołowrotku nieco wcześniej. (Rycina 2) Dokładny czas tego okresu różni się nieznacznie w zależności od szczepu myszy. Na przykład okres wolnobieżny u myszy C57 wynosi około 23,3 godziny, natomiast u myszy BALB/cJ wynosi on 22,5 godziny¹⁰.
4. Po określeniu okresu wolnobieżnego w warunkach stałej ciemności, wpływ bodźców świetlnych na system okołodobowy można zbadać za pomocą przesunięcia fazowego. Przesunięcie fazowe jest zdolnością ostrego impulsu świetlnego do przesunięcia zegara okołodobowego. Przesunięcie fazowe można osiągnąć poprzez podanie krótkiego impulsu światła (15 minut; 1000 lux) podczas fazy aktywnej myszy utrzymywanych w stałej ciemności i pomiar początku aktywności w dniach następujących po tym impulsie świetlnym. (Rycina 4) Wcześniejsze badania pozwoliły stworzyć krzywe odpowiedzi (zwane krzywymi odpowiedzi fazowej), które opisują wielkość i kierunek przesunięcia w zależności od godziny podania światła^{11, 12}. Na przykład 15-minutowy impuls światła o natężeniu 1000 lux podany 4 godziny po rozpoczęciu aktywności (CT16) doprowadzi do 2-godzinnego opóźnienia aktywności, podczas gdy ten sam impuls podany 8 godzin po rozpoczęciu aktywności (CT20) doprowadzi do 2-godzinnego przyspieszenia. (Rycina 4)
5. Aby przetestować bezpośredni wpływ światła na aktywność w kołowrotku, można podać myszom impuls światła podczas fazy ciemnej/aktywnej. Obecność światła w tym czasie zahamuje aktywność w kołowrotku. Choć długość tego impulsu świetlnego może się różnić, ustaliliśmy, że najbardziej informacyjny jest impuls 3-godzinny rozpoczynający się 2 godziny po rozpoczęciu fazy ciemnej. (Rycina 5) W niektórych przypadkach pomocne może być skonsolidowanie aktywności przed tym testem; można to łatwo zrobić, zmieniając cykl świetlny na 16 h światła : 8 h ciemności na tydzień przed podaniem impulsu światła.
6. To bezpośrednie hamowanie aktywności w kołowrotku przez światło można zbadać we wszystkich fazach cyklu okołodobowego, stosując ultradianowy (T7) cykl świetlny¹³. Cykl ten składa się z 3,5 h światła : 3,5 h ciemności przez okres 1 tygodnia¹³. Myszy nie są w stanie przejść fotoentrainmentu, co pozwala impulsom świetlnym wypadać we wszystkich punktach cyklu okołodobowego w trakcie tego tygodniowego zabiegu. (Rycina 6)
7. Podobnie jak w przypadku stałej ciemności, utrzymywanie myszy w stałym świetle ujawni charakterystyczny okres wolnobieżny. Jednak okres ten będzie dłuższy niż okres stwierdzony w stałej ciemności. Długość okresu wolnobieżnego w stałym świetle jest dodatnio skorelowana z natężeniem światła¹⁴; wraz ze wzrostem ilości światła rośnie długość okresu wolnobieżnego. (Rycina 7) Jednak myszy rzadko wykazują okresy przekraczające 26 godzin. Zamiast tego, w silnym świetle ich aktywność staje się arytmiczna. Z tego powodu natężenie światła jest istotnym parametrem, jeśli planuje się porównanie długości okresu w stałym świetle.
8. Decydując o kolejności wykonywania tych zaburzeń świetlnych, należy pamiętać, że wcześniejsze cykle światła mogą wpływać na rytmy okołodobowe. Z tego powodu najlepiej zacząć od najłagodniejszych zabiegów, a następnie stopniowo przechodzić do bardziej drastycznych metod świetlnych. Na przykład testy fotoentrainmentu, stała ciemność i przesunięcia fazowe są bardzo łagodne i nie wydają się prowadzić do długotrwałych efektów. Z drugiej strony, cykl T7 i stałe światło są bardzo drastycznymi zabiegami świetlnymi, które mogą prowadzić do arytmii i powinny zostać zarezerwowane na koniec eksperymentu.

4. Analiza danych

1. Rejestruje się aktywność biegania w kołowrotku, a liczbę obrotów kołowrotka występujących w określonym przedziale czasowym grupuje w przedziały. Przedział ten lub interwał próbkowania wynosi zazwyczaj 10 minut. Dane można wyświetlić w arkuszu kalkulacyjnym Excel, pokazując liczbę obrotów kołowrotka w każdym przedziale. Może to być przydatne do ilościowego określania i porównywania obrotów kołowrotka. Dane można również przedstawić w formie aktogramu, w którym poziom aktywności w każdym przedziale jest reprezentowany przez wysokość czarnego słupka, podobnie jak w histogramie. (Rycina 2)
2. Początek aktywności definiuje się jako start dominującego epizodu aktywności. Dokładne parametry mogą się różnić w zależności od osobnika, ale zazwyczaj poszukujemy pierwszego epizodu aktywności, który trwa dłużej niż 30 minut.
3. Aby przeanalizować zdolność myszy do fotoentrainingu, można zastosować kilka miar. Powszechną metodą uznania myszy za poddaną fotoentrainingowi jest obserwacja stabilnej relacji między początkiem aktywności myszy a wygaśnięciem światła, a także fakt, że duży procent aktywności myszy jest ograniczony do fazy ciemnej.
4. Początek aktywności dostarcza najwięcej informacji podczas badania ponownego synchronizowania z przyspieszeniem cyklu światło/ciemność, natomiast koniec aktywności jest najbardziej informacyjny przy badaniu ponownego synchronizowania z opóźnieniami cyklu światło/ciemność. Myszy zazwyczaj potrzebują 5-7 dni, aby całkowicie ponownie zsynchronizować aktywność biegania w kołowrotku z 6-godzinnym przyspieszeniem lub opóźnieniem cyklu światło/ciemność. Aby uznać mysz za ponownie zsynchronizowaną, szczególnie w odpowiedzi na przyspieszenie, należy zaobserwować stabilną relację między początkiem aktywności a wygaśnięciem światła. Relacja ta powinna być podobna do tej zaobserwowanej przed przyspieszeniem cyklu świetlnego i powinna utrzymywać się przez co najmniej trzy dni. (Rycina 3)
5. Aby obliczyć okres zarówno w stałej ciemności, jak i w stałym świetle, należy wyznaczyć początki aktywności przez 2 tygodnie i dopasować do nich linię regresji. Jak wspomniano wcześniej, u myszy typu dzikiego okres w stałej ciemności będzie krótszy niż 24 godziny, natomiast okres w stałym świetle będzie dłuższy niż 24 godziny. (Ryciny 2 i 7)
6. Obliczając przesunięcie po impulsie świetlnym, należy zacząć od dopasowania linii regresji do początków aktywności przez co najmniej 5 dni przed i 5 dni po impulsie świetlnym. Oblicza się różnicę między tymi dwiema liniami regresji, aby określić wielkość przesunięcia fazowego. (Rycina 4)

5. Reprezentatywne wyniki

Analizując zapisy z kołowrotków, należy spodziewać się kilku godzin ciągłego biegania u każdej myszy. Ponieważ myszy są zwierzętami nocnymi, bieganie to, czyli faza aktywności, będzie korelować z okresem ciemności w warunkach cyklu światło/ciemność. Myszy w wolnym biegu w warunkach stałych również będą wykazywać taki ograniczony okres utrzymującej się aktywności, reprezentujący fazę aktywną ich rytmu endogennego. W stałej ciemności okres ten będzie krótszy niż 24 godziny, a w stałym świetle – dłuższy niż 24 godziny. Podanie 15-minutowego impulsu świetlnego o natężeniu 1000 lux 4 godziny po rozpoczęciu aktywności (CT16) spowoduje opóźnienie początku aktywności w dniach następujących po tym impulsie świetlnym.

Rysunek 1: Reprezentatywne widma światła. A. Widmo światła emitowane przez słońce jest szerokie i stosunkowo jednorodne w zakresie od 400nm do 700nm, co stanowi część widzialną widma światła. B. Widmo żarówki wolframowej osiąga maksimum w zakresie podczerwieni, co powoduje jej przesunięcie w stronę czerwieni, przy niskim natężeniu w zakresie niebieskim. C. Typowa żarówka fluorescencyjna charakteryzuje się dyskretnymi pikami światła, które dla oka wydają się „białe”. D. Jednakże żarówki fluorescencyjne typu daylight mają szersze widmo oraz dyskretne piki częstotliwości. W rezultacie otrzymujemy źródło światła, które nie nagrzewa się tak mocno jak żarówka wolframowa, a posiada szersze widmo niż przeciętna żarówka fluorescencyjna.

Rycina 2: Fotowejście rytmu dobowego. Aktogram jest wykresem aktywności pojedynczej myszy, gdzie na osi y naniesiono kolejne dni, a na osi x czas. Czarne słupki reprezentują liczbę obrotów koła, a tło jest zacieniowane, aby wskazać cykl światło/ciemność. W dniach 1–8 mysz przebywa w cyklu światło:ciemność 12:12. W tym czasie mysz zaczyna biegać w momencie wyłączenia światła i koncentruje swoją aktywność w fazie ciemnej. W fazie jasnej aktywność jest minimalna. W dniu 9 światła zostają wyłączone, pozostawiając mysz w stałej ciemności. Bez cyklu świetlnego brak jest sygnałów wejściowych do zegara biologicznego, co skutkuje działaniem zegara w jego czasie endogenicznym. Jak widać, aktywność rozpoczyna się każdego dnia wcześniej, co wskazuje, że zegar endogeniczny tego zwierzęcia ma okres krótszy niż 24 godziny.

Rycina 3: Ponowna synchronizacja. Paradygmaty ponownej synchronizacji polegają na przesunięciu cyklu świetlnego do przodu lub do tyłu, co zmusza zegar okołodobowy do przystosowania się do nowego cyklu świetlnego. W tym przykładzie cykl zostaje przyspieszony o 6 h w dniu 9, a następnie opóźniony o 6 h w dniu 20. W obu przypadkach pełna ponowna synchronizacja wymaga kilku dni, jednak w zależności od kierunku przesunięcia efekt jest bardziej wyraźny w czasie rozpoczęcia lub zakończenia aktywności.

Rysunek 4: Przesunięcia rytmów okołodobowych w odpowiedzi na krótkie impulsy światła. A. Zwierzęta utrzymywane w stałej ciemności wykazują bieg swobodny z okresem krótszym niż 24 godziny. W dniu 8., 4 godziny po początku aktywności (CT16), podaje się 15-minutowy impuls światła o natężeniu 1000 luksów. W kolejnych dniach obserwuje się przesunięcie czasu początku aktywności. Przesunięcie fazy to różnica między przewidywanym czasem początku aktywności zwierzęcia (wyznaczonym na podstawie aktywności przed impulsem światła) a czasem, w którym zwierzę faktycznie zaczyna biegać w dniach następujących po impulsie światła.
B. Krzywa odpowiedzi fazowej dla myszy pokazuje wielkość i kierunek przesunięcia, które wystąpi w odpowiedzi na krótki impuls światła w określonych czasach okołodobowych. Impuls światła podczas subiektywnego dnia (CT0-12) nie może wywołać znaczącego przesunięcia, co określa się mianem strefy martwej. Od CT12 do CT19 można wywołać opóźnienie fazy, przy czym maksymalne opóźnienie występuje w odpowiedzi na impuls światła w CT16. Między CT19 a CT24 rytm aktywności ulegnie przyspieszeniu w odpowiedzi na impuls światła, a maksymalne przyspieszenie występuje w odpowiedzi na impuls światła w CT20.

Rysunek 5: Aktywność w kołowrotku jest hamowana lub maskowana w odpowiedzi na impuls światła w nocy. W tym przykładzie cykl świetlny wynosi 16h światła: 8h ciemności i konsoliduje aktywność. 3-godzinny impuls światła rozpoczyna się 2 godziny po zgaszeniu świateł w dniu 4. W tym czasie aktywność w kołowrotku jest znikoma lub całkowicie nieobecna, co pokazuje zdolność światła do bezpośredniego hamowania aktywności. Aktywność zostaje wznowiona po ustąpieniu impulsu światła.

Rysunek 6: Cykl świetlny T7 jest wykorzystywany do poddawania myszy impulsom światła w trakcie całego cyklu okołodobowego. Cykl T7 składa się z 3,5 godziny światła, po której następuje 3,5 godziny ciemności. W tym cyklu myszy zachowują rytm okołodobowy, jednak wykazują również maskowanie aktywności biegania w kołowrotku podczas impulsów światła. Ilość aktywności w fazie światła można porównać z ilością aktywności w fazie ciemności w celu pomiaru maskowania, który nie jest obciążony czasem okołodobowym.

Rysunek 7: Wydłużenie okresu w stałym świetle. Dni 1-8 pokazują fotoentrainment myszy podobny do Rysunku 2, jednak w dniu 9 mysz zostaje umieszczona w stałym świetle. W odpowiedzi na ten warunek myszy wykazują bieg swobodny z okresem dłuższym niż 24 godziny, co wskazuje fakt, że początek aktywności występuje każdego dnia później.

Dyskusja

Rytmy okołodobowe były mierzone i rejestrowane u różnych organizmów na przestrzeni historii. Choć szczegółowo opisaliśmy metodę rejestracji rytmów aktywności u myszy, technikę tę można łatwo zmodyfikować w celu pomiaru rytmów u innych gryzoni, takich jak chomiki i szczury, które są często wykorzystywane w badaniach nad rytmami okołodobowymi. Należy jednak pamiętać, że okres wolnobieżny oraz czas ponownej synchronizacji będą się różnić w zależności od organizmu. Na przykład okres wolnobieżny chomika w stałej ciemności wyn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
koła biegowe 11,5 cm	Mini Mitter
oprogramowanie Vital View do akwizycji danych	Mini Mitter
oprogramowanie Clock lab do analizy danych	Actimetrics