Wydrukowane w 3D urządzenie pokryte silikonem do modelowania infekcji dróg moczowych związanych z cewnikiem

Streszczenie

Źródło:
Ocean E. Clarke¹, Romy A. Dop¹, Tom Hasell¹, Joanne L. Fothergill¹, Daniel R. Neill<sup>2

1</sup>Uniwersytet w Liverpoolu, ² Uniwersytet w Dundee

Ten film demonstruje użycie wydrukowanego w 3D, pokrytego silikonem urządzenia, które naśladuje wewnętrzną powierzchnię cewników moczowych w celu symulacji infekcji dróg moczowych związanej z cewnikiem.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobraniem próbek zostały wykonane zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Produkcja addytywna modeli Flexipeg

1. Wydrukuj kołki (wymagane 24 kołki na pokrywę kołka) i pokrywki kołków z żywicy stabilnej w wysokiej temperaturze za pomocą stereolitografii (wysokość warstwy 100 μm).
   NUTA: Żywica stabilna w wysokiej temperaturze jest używana do kołków, a pokrywki kołków można sterylizować w autoklawie przed eksperymentami.
2. Drukuj w 3D zarówno elementy formy, jak i części stojaka na probówki przy użyciu modelowania osadzania topionego (FDM) z 60% wypełnieniem.
   NUTA: Każda trwała żywica nadaje się do FDM, ponieważ formy i stojaki na probówki mogą być sterylizowane etanolem i nie wymagają stabilności w wysokich temperaturach.
3. Upewnij się, że elementy modelu zostały wydrukowane poprawnie i usuń wszelkie nadmiary pozostałości z procesu drukowania za pomocą 70% etanolu.
4. Zamontuj formę maty silikonowej, jak pokazano na rysunku 1, w razie potrzeby przytrzymując boki taśmą.

2. Przygotowanie modelu Flexipeg

1. Przygotowanie maty silikonowej
   1. Odważyć 18 g bazy silikonowej (zasada 10:1 do katalizatora polidimetylosiloksanu (PDMS), utwardzanie kondensacyjne) do zlewki i delikatnie wymieszać z 2 g katalizatora, aż do uzyskania odpowiedniego połączenia.
      NUTA: Unikaj nadmiernego mieszania mieszanki silikonowej, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków w formie.
   2. Wlej połączoną mieszankę silikonu do formy wydrukowanej przez FDM, wycierając nadmiar mieszanki silikonu z boków i górnej części formy. Pozostawić do utwardzenia na noc (minimum 18 godzin) w temperaturze pokojowej (RT).
   3. Wyjmij matę z formy i odetnij nadmiar silikonu po bokach. Upewnij się, że mata pasuje do pokrywy kołka, jak pokazano na rysunku 1.
2. Powłoka kołków
   1. Włóż kołki do maty silikonowej (24 kołki na matę) i przymocuj matę do pokrywy kołka lub plastikowej tacki o podobnych wymiarach do maty za pomocą taśmy.
   2. Odważyć 27 g bazy silikonowej do płytkiej plastikowej tacki (w przybliżeniu o takich samych wymiarach jak płytka 96-dołkowa) i dokładnie wymieszać z 3 g katalizatora, aż dobrze się połączą.
   3. Odwróć pokrywki kołków tak, aby były skierowane w dół, i natychmiast zanurz kołki w mieszance silikonu. Odwróć pokrywkę kołka i pozwól, aby nadmiar silikonu spłynął po kołkach, a kołki utwardziły się przez noc w temperaturze pokojowej.
      NUTA: Silikon szybkoutwardzalny (pełne utwardzenie 6-8 godzin; czas pracy 40-60 min) będzie nadal kapał/spływał przed utwardzeniem; dlatego nie jest konieczne powlekanie całego kołka PDMS podczas zanurzania, ponieważ nadmiar pokryje resztę kołka podczas utwardzania.
   4. Po utwardzeniu powtórz kroki od 2.2.2 do 2.2.3. dopóki kołki nie zostaną trzykrotnie pokryte PDMS. Upewnij się, że pierwsza warstwa powłoki jest całkowicie utwardzona przed przejściem do drugiego etapu powlekania.
      NUTA: Końcowe powłoki kołków powinny mieć grubość <2 mm bez widocznych niedoskonałości. Jeśli silikon pozostaje lepki po całonocnej inkubacji w temperaturze pokojowej, pozostaw go do utwardzenia przez 24 godziny i wyrzuć powłoki, jeśli kołki są nadal lepkie w dotyku.
   5. Za pomocą sterylnego skalpela przyciąć wokół podstawy kołków pokrytych silikonem (jak najbliżej dna), aby usunąć kołki z zestawu powłoki.
      NUTA: Proces ten należy powtarzać, aż do przygotowania żądanej liczby kołków i mat silikonowych. Nadmiar PDMS użyty w procesie powlekania kołków można wykorzystać do odlewania nowych mat silikonowych przed utwardzeniem.
3. Konfiguracja modelu
   1. Włóż powlekane kołki do maty silikonowej i zabezpiecz matę w pokrywie kołka, jak pokazano na rysunku 1.
   2. Przykryj spód pokrywy kołka/maty silikonowej (przymocowanej do podstawy kołka) taśmą do sterylizacji w autoklawie, aby utrzymać kołki na miejscu. Umieść pokrywkę kołka w szczelnie zamkniętej torbie do sterylizacji w autoklawie i sterylizuj w autoklawie przed użyciem.
      NUTA: Kołki w pokrywie kołka będą pasować do 96-dołkowej płytki w jednej pojedynczej orientacji. Po przyklejeniu taśmą konfiguracji kołków sprawdź wyrównanie kołków w zapasowej płytce 96-dołkowej i oznacz taśmę autoklawu zgodnie z prawidłową orientacją pokrywy.

3. Inokulacja modeli

1. Przygotowanie kultury bakteryjnej
   1. Przygotować przez noc kultury izolatów bakteryjnych w teście, zawieszając pętlę kolonii bakteryjnych wyhodowanych na pożywkach stałych w 10 ml bulionu Luria-Bertani (LB). Inkubować przez noc (18 godzin) w temperaturze 37 °C z mieszaniem.
      NUTA: Do stosowania w modelu biofilmu Flexipeg zaleca się co najmniej trzy kontrpróby biologiczne.
   2. Normalizować kultury do OD_{600 nm}0,1 (około 10⁸ jednostek tworzących kolonie (CFU) / ml po rozcieńczeniu płytki) w 1 ml końcowej objętości soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
2. Zakładanie mikropłytek i inokulacja
   1. Podwielokrotność 135 μl zebranego moczu ludzkiego (PHU) do każdej studzienki badanej w 96-dołkowej płytce zgodnie z układem płytek na rysunku 1 (8). Każdy studzienka reprezentuje jedną kontrpróbę techniczną (co najmniej n = wymagane są 3 kontrpróby techniczne na kontrpróbę biologiczną).
      NUTA: Sztuczne media moczowe (AUM) mogą być używane zamiast PHU, jeśli jest to pożądane przez użytkownika.
   2. Zaszczepić każdą studzienkę badaną 15 μl znormalizowanej kultury przez noc, co daje końcową objętość studzienki wynoszącą 150 μl. Zarezerwować co najmniej 100 μl znormalizowanej hodowli nocnej do seryjnych rozcieńczeń w celu walidacji CFU/ml inokulum.
   3. Przygotować kontrole ujemne, rozdzielając 150 μl sterylnego PHU tylko do odpowiednich studzienek.
   4. Po ustawieniu mikropłytki włóż kołki do odpowiednich dołków (zgodnie z ustaleniami przed sterylizacją kołków w autoklawie) i upewnij się, że pokrywka kołka jest zlicowana z powierzchnią płytki. Przykryj pokrywkę kołka pokrywką mikropłytki, przytrzymując ją w razie potrzeby taśmą autoklawową.
   5. Umieść modele kołków w szczelnie zamkniętym plastikowym pojemniku/torbie z wilgotną niebieską rolką, aby zapobiec parowaniu, i inkubuj statycznie przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
3. Walidacja inokulum
   1. Podzielić 180 μl PBS na rzędy 2-6 pierwszej kolumny 96-dołkowej mikropłytki i dodać zarezerwowane 100 μl znormalizowanej kultury nocnej do pierwszego dołka.
   2. Usunąć 20 μl znormalizowanej kultury przez noc z pierwszego dołka i podwielokrotnić do drugiego dołka, delikatnie pipetując w górę i w dół w celu wymieszania.
   3. Powtórzyć krok 3.3.2 aż do momentu, gdy początkowe inokulum zostanie rozcieńczone do ostatniego dołka (1 × 10⁵).
   4. Umieścić plamki po 10 μl z każdego rozcieńczenia na odpowiednich podłożach stałych w trzech egzemplarzach. Inkubować statycznie przez noc w temperaturze 37 °C.
   5. Po inkubacji policz liczbę kolonii w każdym miejscu, aby obliczyć rzeczywistą jtk/ml inokulum.

4. Kwantyfikacja biofilmu

1. Przetwarzanie kołków
   1. Po inkubacji wyjmij model kołka z mikropłytki i odwróć go pod płomieniem lub w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego (kołki skierowane do góry). Wyrzuć mikropłytki.
   2. Przenieść pokrywkę kołka na świeżą mikropłytkę zawierającą 180 μl podwielokrotności sterylnego PBS w celu usunięcia wszelkich nieprzylegających komórek. Powtórz dwa razy w świeżym PBS, w sumie trzy etapy mycia.
      NUTA: Aby zapobiec uszkodzeniom biofilmów związanych z powierzchnią, należy unikać uszkadzania kołków podczas zdejmowania pokrywki kołka z każdej mikropłytki (tj. dotykania krawędzi studzienki).
2. Wyliczanie jtk/ml (związane z biofilmem)
   1. Pracując aseptycznie pod płomieniem lub w komorze bezpieczeństwa mikrobiologicznego, ustaw stojak na probówki (wyprodukowany w kroku 1.2.) ze sterylnymi szklanymi probówkami, jak pokazano na rysunku 1, i przymocuj górną część stojaka, która pasuje do pokrywy kołka.
   2. W aseptyce wprowadzić 600 μl sterylnego PBS do każdej probówki.
   3. Umieść pokrywkę kołków w stojaku, tak aby kołki były wyrównane z rurkami w stojaku. Usuń taśmę autoklawu z pokrywy kołka.
   4. Za pomocą sterylnych kleszczyków przepchnij kołki przez pokrywkę kołka i do odpowiednich probówek wyrównanych poniżej.
   5. Załóż pokrywki probówki i wiruj każdą probówkę przez 60 sekund, aby zdezagregować komórki związane z biofilmem z powierzchni kołka.
   6. Pobrać 100 μl z każdej probówki i seryjnie rozcieńczać, jak opisano wcześniej w kroku 3.3 w sterylnym PBS.
   7. Używając płytki do pipet serologicznych, nanieść 10 μl plamek z każdego rozcieńczenia na odpowiednie podłoża stałe i inkubować statycznie w temperaturze 37 °C przez noc.
   8. Po inkubacji należy policzyć liczbę kolonii na każdej płytce rozcieńczającej i użyć jej do obliczenia CFU/ml.
3. Barwienie fioletem krystalicznym
   1. Podwielokrotność 180 μl 0,1% (w/v) fioletu krystalicznego (w sterylnej wodzie) do 24 dołków testowych 96-dołkowej mikropłytki.
   2. Włóż wypłukany model kołka (kołki i pokrywkę kołka) do odpowiednich dołków mikropłytki. Inkubować statycznie w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
   3. Po inkubacji wyjąć model kołka z mikropłytki i wyrzucić mikropłytkę.
   4. W wannie o odpowiedniej wielkości opłucz cały zestaw kołków w wodzie z kranu, delikatnie mieszając. Powtórz trzy razy.
   5. Odwróć model kołków i pozwól kołkom całkowicie wyschnąć w temperaturze pokojowej.
   6. Podaniec 180 μl 30% kwasu octowego do świeżej 96-dołkowej mikropłytki i włożyć wysuszony model kołka do odpowiednich studzienek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
   7. Usuń model kołka z mikropłytki i odczytaj OD_{540 nm} zabarwionych studzienek za pomocą czytnika mikropłytek lub spektrofotometru.
   8. Aby obliczyć tworzenie się biofilmu na kołkach, należy uśrednić OD_{540 nm} barwionych kołków kontroli ujemnej i odjąć od średniej kołków w teście.

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie konfiguracji modelu Flexipeg. (1) Pojedynczy Flexipeg, pokryty polidimetylosiloksanem (PDMS) w celu odtworzenia powierzchni cewnika moczowego w celu wytworzenia biofilmu. (2) Urządzenie do biofilmu Flex...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikropłytki 96-dołkowe	Greiner	650161	W kształcie litery U/okrągłe dno.
Kwas octowy	SLS	695092-2.5LSIG	≥ 99,7% odczynnik ACS.
Kryształowy fiolet	Merck	Numer katalogowy: 61135-25G
Indywidualny kołek	Na miejscu	Komponenty Flexipeg do druku 3D	Produkcja addytywna z użyciem żywicy stabilnej w wysokiej temperaturze (potrzebne 24 kołki na model Flexipeg). Wyprodukowano przy użyciu żywicy wysokotemperaturowej Formlabs firmy Protolabs (NL).
Rosół Luria-Bertani (LB)	Neogen (Neogen)	NCM0088B	Rosół LB (Miller).
Pokrywka pasująca do płytki 96-dołkowej	Na miejscu	Komponenty Flexipeg do druku 3D	Produkcja addytywna przy użyciu żywicy stabilnej w wysokiej temperaturze.
Forma do przygotowania maty silikonowej	Na miejscu	Komponenty Flexipeg do druku 3D	Produkcja addytywna z dowolnego trwałego materiału. Wyprodukowano przy użyciu żywicy prototypowej ABS firmy Protolabs (NL).
Forma do przygotowania strony maty silikonowej	Na miejscu	Komponenty Flexipeg do druku 3D	Produkcja addytywna z dowolnego trwałego materiału.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Merck	P4417-50TAB
Zgromadzony ludzki mocz	-	-	Pobrane od zdrowych dawców po zatwierdzeniu pod względem etycznym przez centralną uniwersytecką komisję etyczną ds. badań naukowych.
Stojak na rurki szklane	Na miejscu	Komponenty Flexipeg do druku 3D	Produkcja addytywna z dowolnego trwałego materiału.
Silikon (PDMS)	MB Włókno szklane	GP3481-F	Polycraft ogólnego przeznaczenia RTV Utwardzanie kondensacyjne Forma do produkcji kauczuku silikonowego.
Góra, która pasuje do pokrywy kołka	Na miejscu	Komponenty Flexipeg do druku 3D	Produkcja addytywna przy użyciu żywicy stabilnej w wysokiej temperaturze.
Cewniki Foleya	Great Bear Healthcare Wielka Brytania Sp. z o.o.		14 kanałów, 100% silikon