Oczyszczanie wektorów adenowirusowych zawierających genom z wykorzystaniem chlorku cezu

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)

Niniejszy film prezentuje oczyszczanie wysokopojemnych wektorów adenowirusowych z wykorzystaniem ultrawirowania w gradiencie chlorku cezu, co umożliwia oddzielenie wirionów zawierających genom do zastosowań w dostarczaniu genów, charakterystyce wektorów oraz przedklinicznych badaniach terapeutycznych

Protokół

Oczyszczanie i dializa HCAdV (wektorów adenowirusowych o wysokiej pojemności)
1. Aby przygotować lizat wirusowy do gradientów chlorku cezu (CsCl), zamrozić zawiesinę komórkowo-wirusową w ciekłym azocie i rozmrozić w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C (powtórzyć 4x).
2. Odwirować lizat wirusowy przy 500 x g przez 8 min w RT (temperaturze pokojowej) i zebrać nadsącz zawierający HCAdV (wektory adenowirusowe o wysokiej pojemności).
3. Do ultrawirowania przygotować roztwory CsCl w następujący sposób: odważyć odpowiednio 37,5 g (dla 1,5 g/cm³), 33,5 g (dla 1,35 g/cm³) i 31,25 g (dla 1,25 g/cm³) proszku CsCl, a następnie dopełnić dH₂O do 25 ml.
  1. Mieszać do momentu, aż roztwór stanie się klarowny, a następnie przefiltrować roztwory sterylnie. Na koniec odjąć 1 ml każdego roztworu i zważyć na precyzyjnej wadze, aby sprawdzić, czy gęstość jest prawidłowa. 1 ml powinien ważyć odpowiednio 1,5 g, 1,35 g i 1,25 g.
  2. Jeśli gęstość jest zbyt wysoka, skorygować ją poprzez stopniowe dodawanie niewielkich objętości (µl) sterylnej dH₂O. Po dodaniu dH₂O ponownie zmierzyć gęstość. W razie potrzeby dodać więcej dH₂O.
  3. Powtarzać procedurę do uzyskania prawidłowej gęstości. Jeśli gęstość jest zbyt niska, skorygować ją, dodając niewielką ilość proszku CsCl. Ponownie przefiltrować sterylnie i sprawdzić gęstość. Jeśli gęstość będzie zbyt wysoka, skorygować ją poprzez dodanie dH₂O w opisany wcześniej sposób. Jeśli gęstość nadal będzie zbyt niska, dodać więcej CsCl, ponownie przefiltrować sterylnie i sprawdzić gęstość. Powtarzać procedurę do uzyskania prawidłowej gęstości.
4. Przygotować skokowe gradienty CsCl w 6 przezroczystych probkach do ultrawirowania. Ostrożnie i powoli pipetować roztwory CsCl do probówek w następującej kolejności: 0,5 ml roztworu CsCl 1,5 g/cm³, 3 ml roztworu CsCl 1,35 g/cm³ oraz 3,5 ml roztworu CsCl 1,25 g/cm³ (Rycina 1C).
5. Nałożyć ok. 4,5 ml oczyszczonego nadsączu wektorowego z etapu 1.2 na wierzch warstwy CsCl 1,25 g/cm³. Wirować gradienty w ultrawirowarce z rotorem kątowym (SW-41) w temperaturze 12 °C przez co najmniej 2 h przy 226 000 x g (35 000 rpm) z powolnym przyspieszaniem i zwalnianiem, aby oddzielić cząstki wirusowe zawierające genom HCAdV od cząstek pustych i zanieczyszczeń komórkowych.
  UWAGA: W optymalnych warunkach na górze probówek tworzy się rozproszony prążek zanieczyszczeń komórkowych. Poniżej można zaobserwować dwa białe prążki. Górny prążek zawiera cząstki puste, natomiast dolny prążek odpowiada HCAdV (Ryciny 1C i 2A).
6. Ostrożnie usunąć warstwy zanieczyszczeń komórkowych i pustych cząstek, zebrać 1 ml z dolnych prążków z każdej probówki i przenieść wirusa za pomocą czystego końcówki pipety do sterylnej probówki 50 ml. Dodać do zebranych cząstek wirusowych do 24 ml roztworu CsCl 1,35 g/cm³ i ostrożnie wymieszać.
7. Napełnić probówki wirowania roztworem CsCl-wirus 1,35 g/cm³ aż do pełna i wirować O/N (całą noc) (18-20 h) przy 226 000 x g (35 000 rpm) w temperaturze 12 °C w ultrawirowarce z rotorem kątowym (SW-41) z powolnym przyspieszaniem i zwalnianiem.
8. Zebrać HCAdV znajdujący się w wyraźnym dolnym prążku. Ponieważ potencjalny górny prążek zawiera puste cząstki, usunąć górne warstwy z wierzchu za pomocą pipety (patrz Ryciny 1C i 2B). Następnie pobrać dolny prążek za pomocą pipety.
9. Przeprowadzić dializę zebranych cząstek wirusowych w celu wymiany buforu.
  1. Odciąć pasek membrany dializacyjnej (MWCO: 50 000) o długości około 8 cm, przemyć go sterylną dH₂O (powtórzyć 3x). Następnie zamknąć jeden koniec membrany dializacyjnej plastikowym zaciskiem i przenieść zebrany wirus z etapu 5.8 do membrany za pomocą pipety 1 ml. Unikać pęcherzyków powietrza wewnątrz membrany i zamknąć ją z drugiej strony plastikowym zaciskiem dializacyjnym.
  2. Dializować w 1 l buforu dializacyjnego (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10% glicerolu i 1 mM MgCl₂ (chlorku magnezu) w dejonizowanej H₂O) przez 2 h w temperaturze 4 °C przy powolnym mieszaniu. Wymienić bufor dializacyjny na 2 l świeżego buforu dializacyjnego i dializować O/N w temperaturze 4 °C przy powolnym mieszaniu. Alternatywnie można zastosować bufor sacharozowy (140 mM NaCl (chlorku sodu), 5 mM Na₂HPO₄.2H₂O (wodorofosforanu sodu), 1,5 mM KH₂PO₄ (wodorofosforanu potasu) i 730 mM sacharozy, pH 7,8).
  3. Zebrać zdializowane cząstki wirusowe z etapu 1.9.2. za pomocą pipety 1 ml. Przygotować kilka alikwotów o pożądanych małych objętościach (25-100 µl) i przechowywać oczyszczony wirus w temperaturze -80 °C.

Wyniki

Rycina 1. Reprezentatywne wyniki procedury klonowania i uwalniania genomu HCAdV (wektorów adenowirusowych o wysokiej pojemności) z pAdVFTC. (A) Uwolnienie kasety ekspresyjnej genu zainteresowania (GOI) z pHM5 poprzez trawienie enzymami PI-SceI i I-CeuI. (B) Oczyszczona kaseta ekspresyjna GOI oraz oczyszczony, defosforylowany pAdVFTC trawiony odpowiednio PI-SceI i I-CeuI. (C) Analityczne trawienie HincII klonów pAdVFTC z GOI oraz bez GOI. (D) Uwolnienie genomu HCAdV zawierającego GOI z pAdVFTC-GOI poprzez trawienie enzymem NotI

Rycina 2. Reprezentatywne wyniki po wirowaniu w gradiencie chlorku cezu (CsCl). (A) Po zastosowaniu gradientu skokowego (patrz również krok 1.5); (B) Po zastosowaniu gradientu ciągłego (patrz również krok 1.7).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Probówki do ultrawirówki Ultra Clear	Beckmann Coulter	344059	centryfugacja w gradiencie gęstości
Ultrawirówka	Beckmann Coulter		centryfugacja w gradiencie gęstości
Rotor SW-41	Beckmann Coulter		centryfugacja w gradiencie gęstości
Membrana Spectrapor Spectrum Laboratories	VWR	132129	rurki do dializy
Gotowe do użycia kasety do dializy	Thermo	66383	dializa
Chlorek cezu	Carl Roth	8627.1	centryfugacja w gradiencie gęstości
Pożywka LB	Carl Roth	X968.3	pożywka do wzrostu bakterii
Tris-HCl 99%	Carl Roth	9090.3	bufor do dializy/bufor do lizy
Glicerol 99.5%	Carl Roth	3783.1	bufor do dializy
MgCl₂ 98.5%	Carl Roth	KK36.2	bufor do dializy
NaCl	Carl Roth	3957.1	opcjonalny bufor do dializy
KH₂PO₄	Carl Roth	3904.2	opcjonalny bufor do dializy
Sacharoza	Carl Roth	9286.1	opcjonalny bufor do dializy
Na₂HPO₄·2H₂O	Carl Roth	4984.2	opcjonalny bufor do dializy
Probówki 1.5 ml	sarstedt	72,730,005	przechowywanie preparatów wirusowych w -80 °C