Ekspresja wirusowego transgenu w tkankach komór gryzoni UWAGA: Rekombinowany adenowirus lub wirus towarzyszący adenowirusom (AAV) wykazujący ekspresję genu docelowego oraz odpowiadający mu wirus kontrolny, taki jak Ad-GFP (białko fluorescencyjne zielone) (miano 1 x 10¹⁰ jednostek tworzących plaki [PFU]/ml) lub AAV9-GFP (miano 1 x 10¹³ kopii genomu [GC]/ml) (patrz Tabela materiałów), należy przechowywać w zamrażarce w temperaturze −80 °C. W dniu iniekcji wirusa należy rozmrozić go na lodzie. Wirus wykazujący ekspresję genu docelowego oraz wirus kontrolny należy pobrać do dwóch oddzielnych strzykawek (objętość = 50 µl) z igłami 30 G ½ i przechowywać na lodzie do momentu użycia. UWAGA: Wszelkie pęcherzyki powietrza w strzykawce i igle muszą zostać starannie usunięte. Szczurom lub myszom należy podać buprenorfinę (0,05 mg/kg dla szczurów, 0,1 mg/kg dla myszy, podskórnie), a godzinę później wprowadzić w stan anestezji za pomocą 3% izofluranu i utrzymywać stężenie izofluranu na poziomie 2% (w 100% tlenie przy przepływie 0,5–1,0 l/min) podczas dalszej procedury. Należy delikatnie ucisnąć ciało zwierzęcia (np. ogon) pęsetą; jeśli zwierzę nie reaguje na ucisk żadnym ruchem ciała, potwierdza się prawidłowe znieczulenie. Temperaturę ciała należy utrzymywać na poziomie 37 °C, używając elektrycznej podkładki grzewczej. Sierść w okolicy klatki piersiowej należy zgolić maszynką do strzyżenia. UWAGA: Podczas korzystania z elektrycznej podkładki grzewczej należy zachować ostrożność ze względu na możliwość nierównomiernego rozkładu ciepła. Na oba oczy należy nałożyć maść oftalmiczną, aby zapobiec wysychaniu rogówki. Zwierzę należy ułożyć w pozycji na plecach i użyć systemu obrazowania przedklinicznego (patrz Tabela materiałów) do przeprowadzenia badania ultrasonograficznego serca zwierzęcia w orientacji osi krótkiej. UWAGA: Następujące kroki są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego poziomu II, która zapewnia sterylne środowisko. Stosuje się standardowe procedury bezpieczeństwa, w tym zasady bezpiecznego obchodzenia się z igłami. Lewą dolną część klatki piersiowej zwierzęcia należy wysterylizować, wykonując trzykrotnie ruchy okrężne, naprzemiennie stosując preparat do mycia na bazie jodu lub chlorheksydyny oraz alkohol. Pod kontrolą obrazowania ultrasonograficznego należy wprowadzić igłę 30 G 1/2 strzykawki z wirusem, przygotowanej w kroku 1.1, do klatki piersiowej zwierzęcia poprzez lewą dolną stronę klatki piersiowej. Koniec igły należy skierować w stronę przedniej ściany wolnej lewej komory i powoli wstrzyknąć 10–15 μl wirusa. Prawidłowość iniekcji należy zweryfikować na obrazach ultrasonograficznych poprzez zwiększoną jasność w pobliżu końcówki igły. UWAGA: Ilość wirusa wstrzykiwanego w każdym miejscu nie powinna przekraczać 15 μL, aby zapobiec uszkodzeniom mechanicznym tkanek mięśnia sercowego. Należy wycofać igłę z serca i wprowadzić ją w inne obszary lewej komory w celu wykonania drugiej i trzeciej iniekcji tej samej ilości wirusa. UWAGA: Całkowita liczba miejsc iniekcji jest określona przez plan eksperymentu. Jeśli wymagana jest ogniskowa ekspresja transgenu, wystarczy jedna iniekcja; jeśli wymagana jest bardziej dyfuzyjna ekspresja transgenu, zazwyczaj konieczne są wielokrotne miejsca iniekcji (od trzech do pięciu). Po zakończeniu iniekcji zwierzę należy przenieść do klatki. Należy uważnie monitorować zwierzę, aż odzyska ono wystarczającą świadomość, aby utrzymać pozycję grzbietową, a następnie zwrócić je do pomieszczenia chowiego. Przez kolejne 2 dni zwierzęciu należy podawać chlorowodorek buprenorfiny (0,1 mg/kg dwa razy dziennie dla myszy, 0,05 mg/kg dwa razy dziennie dla szczurów, podskórnie). Zwierzęta należy zwrócić do animalarium i codziennie monitorować pod kątem nietypowych objawów bólu lub stresu, a w przypadku ich wystąpienia leczyć zwierzęta zgodnie z protokołami instytucjonalnej komisji ds. opieki nad zwierzętami. Lu, A., i wsp. Wirusowa ekspresja transgenu w sercach gryzoni oraz ocena ryzyka arytmii serca. J. Vis. Exp. (2022)
Wideo demonstruje metodę wstrzykiwania rekombinowanego wektora wirusowego do mięśnia sercowego pod kontrolą ultradźwięków w modelu mysim. Technika ta umożliwia celowane dostarczanie genów do serca w celu zbadania wpływu ekspresji transgenu na funkcję serca.
