Potwierdzenie transdukcji wirusowej w recelularyzowanej wątrobie szczura przy użyciu barwienia immunohistochemicznego

Streszczenie

Źródło: Hiller, T. et. al. Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2. J. Vis. Exp. (2016)

W tym filmie zaprezentowano barwienie immunohistochemiczne w celu oceny transferu genów wirusowych w recelularyzowanym modelu wątroby szczura. Ekspresja reportera, potwierdzona detekcją przeciwciał i kolokalizacją z barwieniem jąder komórkowych, wskazuje na skuteczną transdukcję wirusową w komórkach.

Protokół

1. Transdukcja recelularyzowanej wątroby szczura

1. Produkcja na dużą skalę wektora wirusowego pochodzącego z wirusów towarzyszących adenowirusom (wektor AAV)
   1. Produkcja, oczyszczanie i oznaczanie ilościowe wektorów AAV:
      1. W skrócie: wektory AAV produkuje się w butelkach walcowych i oczyszcza za pomocą wirówki w gradiencie jodiksanolu. Pozostałości jodiksanolu usuwa się poprzez filtrację na kolumnach do filtracji żelowej PD10. Stężenie wektora AAV określa się za pomocą ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej (qPCR), wykorzystując genomowe DNA AAV jako standard.
         UWAGA: Samokomplementarny, pseudotypowany wektor AAV2/6 użyty w niniejszym badaniu kodował szmaragdowe zielone fluorescencyjne białko reporterowe, EmGFP, jako reporter do wykazania wydajności transdukcji oraz kasetę ekspresyjną krótkiego rybowego RNA spinka (shRNA) do wyciszenia endogennie ekspresowanego genu (ludzkiej cyklofiliny B (hCycB), Rysunek 1). Należy zapewnić odpowiednią ilość pseudotypowanych wektorów scAAV serotypu 6 (2,7 x 10¹³ wektorów AAV na model wątroby).
2. Transdukcja modelu wątroby
   1. Doprowadzić roztwór wektora AAV do końcowego stężenia 2,7 x 10¹³ genomów wektorowych w 5 mL, dodając odpowiednią objętość soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS).
   2. Odłączyć wątrobę od obiegu pożywki, zdejmując dren z kaniuli. Podłączyć strzykawkę 5 mL do kaniuli żyły wrotnej i wstrzyknąć cały roztwór wektora AAV (5 mL).
      UWAGA: Opcjonalnie można dodać czerwień fenolową (5 µg/ml), aby śledzić rozprzestrzenianie się roztworu wektora AAV w całej wątrobie.
   3. Inkubować przez 1 hr bez pompowania. Stopniowo zwiększać szybkość przepływu, zaczynając od 1,25 ml/min przez 10 min; 2,5 ml/min przez 20 min oraz 3,75 ml/min przez 30 min. Hodować recelularyzowaną wątrobę szczura przez 6 dni.

2. Ocena recelularyzowanej i przetransdukowanej wątroby szczura

1. Barwienie hematoksyliną i eozyną (HE) oraz analiza immunohistochemiczna
   1. Pobrać próbki (0,5 x 0,5 x 1,5-2 cm) z każdego płata wątroby za pomocą skalpela.
   2. Inkubować próbki w roztworze 4% paraformaldehydu (PFA) + 4% sacharozy przez 1,5 hr w 4 °C. (Uwaga: PFA jest toksyczny i rakotwórczy. Zawsze należy przechowywać PFA w dygestorium i nosić odpowiednią odzież ochronną). Przemyć trzykrotnie PBS (1 min na każdy etap płukania) i inkubować w 8% sacharozie przez noc w 4 °C.
   3. Nalać medium utrwalające do plastikowych form do kriotomii i umieścić w nim próbki, dbając o brak pęcherzyków powietrza. Dolać medium utrwalające, aż próbka zostanie całkowicie przykryta. Przechowywać zatopione próbki w -80 °C do czasu dalszego użycia.
   4. Przygotować skrawki mrożone (10 µm) za pomocą kriotomu. Ocenić recelularyzację za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną. Ocenić wydajność transdukcji za pomocą barwienia immunohistochemicznego na gen zainteresowania (tutaj: EmGFP).

Wyniki

Rysunek 1. Mapa samouzupełniającego, pseudotypowanego wektora AAV2/6 użytego w niniejszym badaniu. Genom składa się z odwróconych powtórzeń końcowych (ITR) AAV2 i koduje EmGFP pod kontrolą promotora CMV oraz shRNA pod kontrolą promotora U6.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Tissue-Tek O.C.T.	Weckert-Labortechnik	600001
Kriomatryca 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566
Inkubator	Fraunhofer	/