Generowanie komórek z warunkowym wyciszeniem genu z wykorzystaniem tetracyklinowo-responsywnego lentiwirusego systemu ekspresji shRNA

Streszczenie

Źródło: Kubala, M. H. & DeClerck, Y. A. Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment. J. Vis. Exp. (2017)

W tym filmie zaprezentowano generowanie linii komórkowych nowotworowych z warunkowym wyciszeniem genów (knockdown) przy użyciu systemu lentiwirusowego shRNA indukowanego tetracykliną (Tet). Przedstawiono w nim etapy transdukcji wirusowej, selekcji antybiotykowej oraz indukowanego doksycykliną wyciszania genów.

Protokół

1. Generowanie stabilnie transdukowanych linii komórkowych
   1. Wysiać komórki raka jelita grubego HCT116 oraz komórki raka piersi MDA-MB-231 w zagęszczeniu 50 000 komórek/dołek w podłożu Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (Pen/Strep) na płytce 12-dołkowej. Inkubować w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂ do momentu uzyskania 60 - 70% konfluencji komórek.
   2. Przemyć komórki solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), dodać 1 mL podłoża zawierającego wirusa do komórek nowotworowych i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂. Jako kontrolę, do 2 dołków z komórkami nowotworowymi dodać 1 mL świeżego podłoża DMEM uzupełnionego o 10% FBS i 1% Pen/Strep.
   3. Ostrożnie usunąć podłoże zawierające wirusa za pomocą aspiratora. Przemyć komórki PBS i wymienić podłoże na DMEM z 10% (v/v) FBS wolnym od tetracykliny (Tet-free) i 1% Pen/Strep.
   4. Po 72 h przemyć komórki PBS i wymienić podłoże na DMEM z 10% Tet-free FBS, 1% Pen/Strep oraz 1 µg/mL puromycyny w celu selekcji komórek transdukowanych wirusem.
      1. W zależności od użytej linii komórkowej dostosować stężenie puromycyny dla optymalnej selekcji, testując zakres stężeń puromycyny (0,1, 0,5, 1, 2 i 5 µg/mL) na komórkach nietransdukowanych i wybierając najniższe stężenie, przy którym żadne komórki kontrolne nie przeżyją po 3 dniach hodowli.
   5. Wyselekcjonować komórki transdukowane wirusem poprzez hodowlę w obecności puromycyny przez 3 - 14 dni. Jako kontrole przygotować dwa dodatkowe dołki z komórkami nietransdukowanymi: jeden z podłożem zawierającym puromycynę i jeden bez puromycyny. Zaobserwować częściowe zabijanie komórek przez puromycynę w dołku z komórkami transdukowanymi wirusem w porównaniu do dołków kontrolnych.
      UWAGA: Komórki nietransdukowane nie będą rosły w obecności puromycyny.
   6. Zweryfikować wydajność warunkowego wyciszenia (KD) w opornych na puromycynę komórkach raka jelita grubego HCT116 i raka piersi MDA-MB-231.
      UWAGA: Efektywne stężenie doksycykliny będzie różnić się w zależności od użytej linii komórkowej i musi zostać miareczkowane (zazwyczaj od 100 ng/mL do 2 µg/mL).
      1. Wyznaczyć stężenie doksycykliny, które nie jest toksyczne dla komórek, ale jest skuteczne w obniżaniu ekspresji białka docelowego. W niniejszym protokole w warunkach in vitro z powodzeniem zastosowano stężenie 1 µg/mL.
      2. Hodować komórki przez 72 h w obecności i w nieobecności 0,1, 1 i 2 µg/mL doksycykliny. Zweryfikować poziom ekspresji wyciszonego białka (tutaj inhibitora aktywatora plazminogenu 1 (PAI-1)) w lizacie komórkowym za pomocą analizy Western blot. Porównać komórki HCT116 i MDA-MB-231 warunkowo eksprimujące krótkie interferujące RNA (shRNA) z komórkami kontrolnymi z sekwencją scrambled.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
wektor lentiwirusowy Tet-pLKO-puro	Addgene	21915
FBS (wolne od tetracykliny)	Omega Scientific	FB-15
wektor psPAX	Addgene	12260
wektor pMD2.G	Addgene	12259
komórki HEK293	ATCC	CRL-1573
PBS	Corning	21-031-CV
pożywka DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Corning	10-013-CV
roztwór soli fosforanowej (PBS)	Corning	21-031-CV
kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375
Puromycyna	Sigma-Aldrich	P9620
Hiklian doksycykliny	Sigma-Aldrich	D9891-25g
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)	Corning	10-040-CV
penicylina-streptomycyna	Gibco	15140122