Koncentracja cząsteczek wirusowych poprzez ultrawirowanie UWAGA: Stosujemy metodę oczyszczania z użyciem podwójnej warstwy sacharozy, która składa się z dwóch etapów: etapu gradientu sacharozowego oraz etapu poduszki sacharozowej (rycina 1). W celu stworzenia gradientu sacharozowego należy napełnić stożkowate probówki do ultrawirowania w następującej kolejności: 0,5 ml sacharozy 70% (rozpuszczonej w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo [PBS]), 0,5 ml sacharozy 60% (rozpuszczonej w DMEM), 1 ml sacharozy 30% (rozpuszczonej w modyfikowanej przez Dulbecco pożywce Eagle'a [DMEM]) oraz 2 ml sacharozy 20% (rozpuszczonej w 1x PBS). Ostrożnie dodaj nadpłyn zawierający wirusy do gradientu. Ponieważ całkowita objętość nadpłynu z czterech płytek o średnicy 15 cm wynosi 100 ml, należy użyć sześciu probówek do ultrawirowania na jeden cykl, aby przetworzyć pełną objętość nadpłynu wirusowego. Każda probówka do ultrawirowania stosowana na tym etapie ma pojemność do 30 ml (wliczając objętość sacharozy). Rozdziel nadpłyn wirusowy równomiernie pomiędzy probówki, pozostawiając co najmniej 10% wolnej przestrzeni nad cieczą, aby zapobiec rozlaniu. W przypadku użycia więcej niż czterech płytek 15 cm w jednym doświadczeniu, dostosuj objętość hodowli do poziomu ~20–22 ml na płytkę, tak aby końcowa objętość połączonego nadpłynu wirusowego mogła bez problemu zmieścić się w sześciu probówkach do ultrawirowania. Napełnij probówki do ultrawirowania do co najmniej trzech czwartych ich całkowitej pojemności; w przeciwnym razie podczas wirowania może dojść do pęknięcia probówek, co może skutkować utratą próbki i/lub uszkodzeniem sprzętu. Zrównoważ probówki za pomocą 1x PBS i wiruj próbki przy 70 000 x g przez 2 h w temperaturze 17 °C. UWAGA: Aby zapobiec zaburzeniu warstwy sacharozy podczas przyspieszania, ustaw ultrawirowkę tak, aby rotor powoli przyspieszał do 200 obr./min w ciągu pierwszych 3 min wirowania. Podobnie, ustaw ultrawirowkę na powolne zwalnianie rotora z 200 obr./min do 0 obr./min w ciągu 3 min na koniec wirowania. Ostrożnie zbierz frakcje sacharozy 30–60% do czystych probówek (rycina 1). Do połączonych frakcji dodaj zimny 1x PBS i uzupełnij objętość do 100 ml; wymieszaj, kilkakrotnie pipetując zawartość w górę i w dół. Przejdź do etapu poduszki sacharozowej, ostrożnie nakładając preparat wirusowy na poduszkę sacharozową. W tym celu dodaj do probówki 4 ml sacharozy 20% (w 1x PBS), a następnie ok. 20–25 ml roztworu wirusowego na probówkę. Jeśli probówki są wypełnione w mniej niż trzech czwartych objętości, uzupełnij je sterylnym 1x PBS. Starannie zrównoważ i wiruj próbki przy 70 000 x g przez 2 h w temperaturze 17 °C, analogicznie jak poprzednio. Odlej nadpłyn i pozwól pozostałej cieczy spłynąć, odwracając probówki na ręcznikach papierowych. Odssij pozostałe krople, aby usunąć całą ciecz z osadu. Na tym etapie osady zawierające wirusy powinny być ledwo widoczne jako małe, półprzezroczyste punkty. Resuspenduj osady, dodając 70 µl 1x PBS do pierwszej probówki i dokładnie pipetując zawiesinę, a następnie przenosząc zawiesinę do kolejnej probówki i mieszając w ten sam sposób, aż wszystkie osady zostaną zresuspendowane. Przepłucz probówki dodatkowymi 50 µl zimnego 1x PBS i wymieszaj w ten sam sposób. Upewnij się, że łączna objętość końcowej zawiesiny wynosi ~120 µl i ma lekko mleczny wygląd; oczyść ją poprzez wirowanie przy 10 000 x g przez 30 s w mikrowirowce stołowej. Przenieś nadpłyn do nowej probówki do mikrowirowania, przygotuj alikwoty po 10 µl i przechowuj je w temperaturze -80 °C. UWAGA: Unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania próbek lentiwirusowych. Poza etapami wymagającymi wirowania, pozostałe czynności należy starać się wykonywać w komorach z laminarnym przepływem powietrza do hodowli tkanek lub w wyznaczonych pomieszczeniach do hodowli tkanek, stosując odpowiednie środki bezpieczeństwa biologicznego. Vijayraghavan, S. i Kantor, B. Protokół produkcji lentiwirusek wektorowych z deficytem integrazji do wyciszania genów za pomocą systemu CRISPR/Cas9 w komórkach dzielących się. J. Vis. Exp., (2017)
W niniejszym filmie zaprezentowano dwuetapową metodę ultrawirowania z wykorzystaniem gradientów i poduszek sacharozowych w celu oczyszczenia i skoncentrowania cząsteczek wirusowych z supernatantu hodowli komórkowej. Procedura ta umożliwia rozdzielenie cząsteczek na podstawie ich gęstości wypornościowej, co pozwala na odzyskanie nienaruszonych wirusów odpowiednich do dalszych zastosowań.
