Oznaczanie miana lentiwirusów metodą enzymatycznego testu immunosorpcyjnego (ELISA)

Streszczenie

Źródło: Vijayraghavan, S., et al. Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).

W niniejszym filmie zaprezentowano zastosowanie testu p24 ELISA do szacowania miana wirusowego wektorów lentiwirusowych. Metoda ta polega na lizie cząstek wirusowych w celu uwolnienia białka p24, jego wychwyceniu za pomocą swoistych przeciwciał oraz detekcji z wykorzystaniem układu sprzężonego z peroksydazą, który powoduje mierzalną zmianę barwy. Miano wirusa jest określane ilościowo poprzez porównanie wartości absorbancji próbek z krzywą wzorcową.

Protokół

1. Oznaczanie miana wirusa

1. Metoda enzymatycznego testu immunosorpcyjnego (ELISA) dla białka kapsydu p24 (ludzki wirus niedoboru odporności (HIV)-1 p24)UWAGA: Analizę przeprowadza się przy użyciu płytek 96-dołkowych o wysokim wiązaniu zgodnie z instrukcjami programu NIH AIDS Vaccine Program dla zestawu HIV-1 p24 Antigen Capture Assay Kit (patrz Tabela materiałów) z wprowadzonymi modyfikacjami.
   1. Następnego dnia dołki należy przemyć trzy razy 200 µL 0,05% Tween 20 w zimnym PBS (roztwór PBS-T). Płytkę pokrywa się 100 µL monoklonalnego przeciwciała anty-p24 w rozcieńczeniu 1:1500 w 1x PBS i inkubuje przez noc w 4 °C.
   2. Aby wyeliminować nieswoiste wiązanie, płytkę blokuje się 200 µL 1% BSA w PBS; następnie przemywa trzy razy 200 µL 0,05% Tween 20 w zimnym PBS (roztwór PBS-T) przez co najmniej 1 h w temperaturze pokojowej.
   3. Przygotowanie próbek: W przypadku stężonych preparatów wektora 1 µL próbki rozcieńcza się 100-krotnie, dodając 89 µL dd-H20 i 10 µL Triton X-100 (stężenie końcowe 10%). W przypadku preparatów niestężonych przygotowuje się próbki rozcieńczone dziesięciokrotnie (dodając 80 µL dd-H20 i 10 µL Triton X-100 (stężenie końcowe 10%) do 10 µL próbki). UWAGA: Na tym etapie próbki można przechowywać w -20 °C przez dłuższy czas do późniejszego wykorzystania.
   4. Standardy HIV-1 przygotowuje się poprzez wykonanie 2-krotnych rozcieńczeń seryjnych (przy stężeniu początkowym 5 ng/mL).
   5. Stężone próbki (z roztworów wstępnie rozcieńczonych 1:100) rozcieńcza się w pożywce RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640) uzupełnionej o 0,2% Tween 20 i 1% BSA, aby uzyskać rozcieńczenia 1:10 000, 1:50 000 i 1:250 000. Próbki niestężone (z roztworów wstępnie rozcieńczonych 1:10) rozcieńcza się w RPMI 1640 uzupełnionej o 0,2% Tween 20 i 1% BSA, aby uzyskać rozcieńczenia 1:500, 1:2500 i 1:12 500.
   6. Próbki nanosi się na płytkę w trzech powtórzeniach i inkubuje przez noc w 4 °C.
   7. Następnego dnia dołki przemywa się sześć razy i inkubuje w 37 °C przez 4 h z 100 µL poliklonalnego króliczego przeciwciała anty-p24, rozcieńczonego 1:1000 w RPMI 1640, 10% FBS, 0,25% BSA i 2% normalnego surowicy mysiej (NMS).
   8. Przemywa się sześć razy jak wyżej i inkubuje w 37 °C przez 1 h z kozim przeciwciałem IgG anty-króliczym sprzężonym z peroksydazą chrzanową, rozcieńczonym 1:10 000 w RPMI 1640 uzupełnionej o 5% normalnej surowicy koziej, 2% NMS, 0,25% BSA i 0,01% Tween 20.
   9. Płytkę przemywa się jak wyżej i inkubuje z substratem peroksydazy TMB (3,3′,5,5′-tetrametylobenzydyna) w temperaturze pokojowej przez 15 min.
   10. Reakcję zatrzymuje się poprzez dodanie 100 µL 1 N HCL. Absorbancję próbek mierzy się przy 450 nm przy użyciu płytkowego czytnika absorbancji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynniki do testu ELISA p24
Przeciwciało monoklonalne anty-p24	Program Badań nad AIDS i Odczynników Referencyjnych NIH	3537
Standardy HIV-1	NIH AIDS Research and Reference Reagent Program	SP968F
Poliklonalne przeciwciało królicze anty-p24	Program Badań i Odczynników Referencyjnych AIDS NIH	SP451T
Kozia przeciwkrólicza IgG sprzężona z peroksydazą chrzanową	Sigma Aldrich	12-348	Stężenie robocze 1:1500
Normalne surowica mysia, sterylna, 500 ml	Equitech-Bio	SM30-0500
Surowica kozia, sterylna, 10 ml	Sigma	G9023	Stężenie robocze 1:1000
podłoże peroksydazy TMB (3,3′,5,5′-tetrametylobenzydyna)	KPL	5120-0076	Stężenie robocze 1:10 000