Generowanie rekombinowanego wirusa adeno-zależnego poprzez transfekcję plazmidową

Streszczenie

Źródło: Ding, J., et al. Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (2016)

Ten film prezentuje produkcję cząsteczek rekombinowanego wirusa towarzyszącego adenowirusom poprzez transfekcję plazmidową w komórkach ssaków. Przedstawiono w nim skoordynowaną ekspresję białek Rep, Cap oraz białek pomocniczych, które napędzają replikację genomu wirusowego i składanie kapsydu w jądrze komórkowym.

Protokół

1. Transfekcja komórek HEK293 plazmidami rekombinowanego wirusa adeno-związanego typu 9 (rAAV9)

1. Przygotować roztwór liniowej polietylenoiminy (PEI) o stężeniu 1 µg/µl. Proszek PEI rozpuścić w wolnej od endotoksyn dH₂O podgrzanej do 70-80 °C. Po ochłodzeniu do RT zneutralizować roztwór do pH 7,0 za pomocą 1 M HCl. Roztwór wysterylizować przez filtr (0,2 µm). Roztwór stokowy PEI 1 µg/µl rozdzielić na alikwoty (1 40 µl/probówka) i przechowywać w temperaturze -20 °C.
2. Hodować komórki HEK293 w pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny. Komórki hodować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy zawartości 5 ± 0,5% dwutlenku węgla (CO₂).
3. W dniu 0, na 18-20 h przed transfekcją, wysiać komórki HEK293 do dziesięciu naczyń o średnicy 150 mm, dzieląc komórki o konfluencji > 90% w rozcieńczeniu 1:2.
   UWAGA: W dniu 1 komórki powinny osiągnąć 90% konfluencji.
4. W dniu 1 przeprowadzić transfekcję komórek HEK293 przy użyciu PEI, wprowadzając plazmid rAAV9 (np. konstrukty rAAV9.cTNT::GFP lub rAAV6.U6::shRNA), plazmid Ad-Helper oraz plazmid AAV-Rep/Cap.
   1. Dla 10 naczyń z komórkami o 90% konfluencji zmieszać 70 µg plazmidu AAV-Rep/Cap, 70 µg plazmidu rAAV9 oraz 20 µg plazmidu Ad-Helper w 50-ml probówce do wirowania.
   2. Jeśli konfluencja komórek jest niższa, proporcjonalnie dostosować ilość DNA. Na przykład, jeśli konfluencja wynosi 75%, należy proporcjonalnie zmniejszyć ilość DNA (75/90 ilości podanej w kroku 1.4.1): zmieszać 70 x 75/90 = 58,3 µg plazmidu AAV-Rep/Cap, 70 x 75/90 = 58,3 µg plazmidu rAAV9 oraz 20 x 75/90 = 16,7 µg plazmidu Ad-Helper w 50-ml probówce do wirowania.
   3. Do probówki 50-ml dodać 49 ml DMEM w temperaturze RT (bez FBS) i dokładnie wymieszać.
   4. Dodać 1 360 µl roztworu PEI, aby uzyskać stosunek PEI:DNA (v/w) wynoszący 4:1. Dokładnie wymieszać. Inkubować w temperaturze RT przez 15-30 min.
   5. Do każdego naczynia 150-mm dodać 5 ml mieszaniny przygotowanej w kroku 1.4.4 (łącznie 50 ml mieszaniny dla dziesięciu naczyń 150-mm).
5. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5 ± 0,5% CO₂ przez 60-72 h.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Polyethylenimina liniowa (MW 25 0)	Polysciences, Inc.	#23966-2
Probówka polipropylenowa, 36,2 ml, 25 x 87 mm (ilość: 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
Pożywka DMEM	Fisher Scientific	SH30243FS
Płodowa surowica bydlęca	Atlanta Biologicals	S150
Wektor rAAV9	Penn Vector Core	P1967