Oczyszczanie rekombinowanych cząstek wirusa z transfekowanych ludzkich komórek nerkowych

Streszczenie

Źródło: Ding, J. et. al., Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (2016)

W niniejszym filmie przedstawiono oczyszczanie rekombinowanych cząstek wirusowych z transfektowanych ludzkich komórek nerkowych. Wirus jest uwalniany poprzez lizę w cyklach zamrażania i rozmrażania, a następnie oczyszczany przy użyciu gradientów jodiksanolu z filtracją wspomaganą kopolimerem blokowym.

Protokół

1. Transfekcja komórek HEK293 plazmidami rekombinowanego wirusa towarzyszącego adenowirusom 9 (rAAV9)
   1. Przygotować roztwór liniowej polietylenoiny (PEI) o stężeniu 1 µg/µl. Proszek PEI rozpuścić w wodzie dH₂O wolnej od endotoksyn, podgrzanej do 70-80 °C. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej (RT) zneutralizować roztwór do pH 7,0 za pomocą 1 M kwasu solnego (HCl). Roztwór wysterylizować za pomocą filtracji (0,22 µm). Rozdzielić roztwór stokowy PEI 1 µg/µl na aalikwoty (1400 µl/probówka) i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   2. Hodować komórki HEK293 w podłożu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) z dodatkiem 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy stężeniu dwutlenku węgla (CO₂) 5 ± 0,5%.
   3. W dniu 0, na 18-20 h przed transfekcją, wysiać komórki HEK293 do dziesięciu szalek o średnicy 150 mm, dzieląc komórki o konfluencji > 90% w rozcieńczeniu 1:2.
      UWAGA: W dniu 1 komórki powinny osiągnąć 90% konfluencji.
   4. W dniu 1 przeprowadzić transfekcję komórek HEK293 plazmidem rAAV9 (np. konstruktami rAAV9.cTNT::GFP lub rAAV6.U6::shRNA), plazmidem Ad-Helper oraz plazmidem AAV-Rep/Cap przy użyciu PEI.
      1. Dla 10 szalek z komórkami o 90% konfluencji wymieszać w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml 70 µg plazmidu AAV-Rep/Cap, 70 µg plazmidu pfrAAV9 oraz 200 µg plazmidu Ad-helper.
      2. Jeśli konfluencja komórek jest niższa, dostosować ilość DNA proporcjonalnie. Na przykład, jeśli konfluencja wynosi 75%, zmniejszyć ilość DNA proporcjonalnie (75/90 ilości podanej w kroku 2.4.1): wymieszać w probówce wirówkowej 50 ml 70 x 75/90 = 58,3 µg plazmidu AAV-Rep/Cap, 70 x 75/90 = 58,3 µg plazmidu rAAV9 oraz 200 x 75/90 = 166,7 µg plazmidu Ad-Helper.
      3. Dodać 49 ml DMEM w temperaturze pokojowej (bez FBS) do probówki 50 ml i dokładnie wymieszać.
      4. Dodać 1360 µl roztworu PEI, aby uzyskać stosunek PEI:DNA (v/w) wynoszący 4:1. Dokładnie wymieszać. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15-30 min.
      5. Dodać 5 ml mieszaniny przygotowanej w kroku 1.4.4 do każdej szalki 150 mm (łącznie 50 ml mieszaniny dla dziesięciu szalek 150 mm).
   5. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy stężeniu CO₂ 5 ±0,5% przez 60-72 h.
2. Zbiór transfekowanych komórek HEK293 i oczyszczanie wektorów rAAV9
   1. Zebrać komórki 60-72 h po transfekcji. Odczepić i zawiesić komórki w szalkach, pipetując pożciagowo pożywkę hodowlaną. Przenieść wszystkie zawiesiny komórkowe do sterylnych probówek 50 ml.
   2. Wirować komórki przy 500 x g przez 5 min. Resuspendować osad komórkowy w 5 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) w każdej probówce i połączyć wszystkie zawiesiny komórkowe w jednej probówce 50 ml.
   3. Wirować komórki przy 500 x g przez 5 min. Odlać nadsącz. Na tym etapie osad komórkowy można przechowywać w -80 °C lub natychmiast przystąpić do oczyszczania AAV z osadu, zgodnie z opisem w krokach 2.4-2.15.
   4. Przygotować bufor do lizy: 150 mM chlorku sodu (NaCl) i 20 mM chlorowodorku Tris(hydroksymetyl)aminometanu (Tris-HCl, pH 8,0). Wysterylizować za pomocą filtracji (0,22 µM). Przechowywać bufor w temperaturze 4 °C.
   5. Resuspendować osad w 10 ml buforu do lizy.
   6. Zamrozić lizat w temperaturze -80 °C lub w kąpieli z suchego lodu i etanolu, a następnie rozmrozić w 37 °C. Mieszać na wirówce vortex przez 1 min. Powtórzyć cykl zamrażania i rozmrażania lizatu 3 razy.
   7. Dodać roztwór chlorku magnezu (MgCl₂) do rozmrożonego lizatu (tak, aby końcowe stężenie MgCl₂ w lizacie wynosiło 1 mM). Dodać nukleazę do końcowego stężenia 250 U/ml. Inkubować w 37 °C przez 15 min w celu rozpuszczenia agregatów DNA/białek.
      UWAGA: Jeśli agregaty DNA/białek nie rozpuszczą się po traktowaniu nukleazą lub endonukleazą, poddać lizaty homogenizacji za pomocą homogenizatora dounce 20 razy.
   8. Wirować próbkę przy 4800 x g przez 20 min w 4 °C. Zebrać nadsącz.
   9. W międzyczasie przygotować roztwór gradientu jodiksanolowego:
      1. Przygotować 17% roztwór gradientu, mieszając 5 ml 10x PBS, 0,05 ml 1 M MgCl₂, 0,125 ml 1 M chlorku potasu (KCl), 10 ml 5 M NaCl oraz 12,5 ml medium do gradientu gęstości. Uzupełnić całkowitą objętość do 50 ml wodą H₂O.
      2. Przygotować 25% roztwór, mieszając 5 ml 10x PBS, 0,05 ml 1 M MgCl₂, 0,125 ml 1 M KCl, 20 ml medium do gradientu gęstości oraz 0,2 ml 0,5% (w/v) czerwieni fenolowej. Uzupełnić całkowitą objętość do 50 ml wodą H₂O.
      3. Przygotować 40% roztwór, mieszając 5 ml 10x PBS, 0,05 ml 1 M MgCl₂, 0,125 ml 1 M KCl oraz 33,3 ml medium do gradientu gęstości. Uzupełnić całkowitą objętość do 50 ml wodą H₂O.
      4. Przygotować 60% roztwór, mieszając 0,05 ml 1 M MgCl₂, 0,125 ml 1 M KCl, 50 ml medium do gradientu gęstości oraz 0,1 ml 0,5% (w/v) czerwieni fenolowej.
   10. Za pomocą igły i strzykawki nanieść roztwór gradientu jodiksanolowego do probówki polipropylenowej w kolejności: 5 ml 17%, 5 ml 25%, 5 ml 40% i 5 ml 60%, zaczynając od dołu. Nanieść cały lizat uzyskany w kroku 3.8 (14-16 ml) na górę gradientu. Gradient, liczony od dołu do góry, składa się z warstw: 60%, 40%, 25%, 17% oraz warstwy lizatu. Wypełnić probówkę buforem do lizy i zamknąć korkiem.
   11. Wirować przy 185 000 x g przez 90 min w 16 °C.
   12. Zebrać frakcję wirusową (warstwa 40%) za pomocą strzykawki. Wprowadzić igłę (rozmiar 21 G) na granicę między frakcją 40% a 60%, aspirując wyłącznie warstwę 40%.
       UWAGA: Należy unikać aspiracji warstwy 25%.
   13. Wymieszać frakcję wirusową ze sterylnym roztworem PBS z kopolimerem blokowym polioksyetylenu i polioksypropylenu (roztwór stokowy 10% kopolimeru blokowego polioksyetylenu i polioksypropylenu rozcieńczony w PBS 1:10 000) do całkowitej objętości 15 ml. Nanieść mieszaninę do probówki z filtrem (MW cut-off = 100 kD). Wirować przy 2000 x g przez 30 min w 4 °C.
   14. Odlać roztwór z dna. Ponownie napełnić probówkę z filtrem roztworem PBS z kopolimerem blokowym polioksyetylenu i polioksypropylenu do całkowitej objętości 15 ml. Wirować przy 2000 x g przez 20 min w 4 °C. Powtórzyć ten krok jeszcze dwa razy. Zebrać oczyszczonego wirusa rAAV9 (frakcja nad filtrem).
   15. Przenieść oczyszczony rAAV9 z probówki z filtrem do probówek 1,7 ml. Rozdzielić oczyszczonego rAAV9 na aalikwoty (100-400 µl/probówka, w zależności od objętości i miana AAV) i przechowywać wirusa w -80 °C.
       UWAGA: Należy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Polyethylenimin, liniowy (MW 25,000)	Polysciences, Inc.	#23966-2
Probówka, polipropylenowa, 36.2 ml, 25 x 87 mm, (ilość 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
Nukleaza, ultrapure	SIGMA	#E8263-25KU
Medium do gradientu gęstości (jodiksanol)	SIGMA	#D1556-250ML
Odwirnik filtracyjny z membraną Ultracel-100	EMD Millipore Corporation	#UFC910008
Laboratoryjna igła pipetująca z tępym zakończeniem 90°, rozmiar 14, L 6 in., z niklowanym piastą	SIGMA	#CAD7942-12EA
Roztwór poloksameru 188 (roztwór Pluronic® F-68)	SIGMA	P5556-100ML
Proteinaza K	SIGMA	3115828001
DNaza I	Roche	10104159001
Wirówka	Thermo Scientific	75004260
System wirówkowy	Beckman Coulter	363118
Ultrawirówka	Beckman Coulter
Pożywka DMEM	Fisher Scientific	SH30243FS
Pł TkŁ (płódwołowa surowica)	Atlanta Biologicals	S11150
Wektor rAAV9	Penn Vector Core	P1967