Oczyszczanie rekombinowanych cząstek wirusa z transfekowanych ludzkich komórek nerkowych

Streszczenie

Źródło: Ding, J. et. al., Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts. J. Vis. Exp. (2016)

W niniejszym filmie przedstawiono oczyszczanie rekombinowanych cząstek wirusowych z transfektowanych ludzkich komórek nerkowych. Wirus jest uwalniany poprzez lizę w cyklach zamrażania i rozmrażania, a następnie oczyszczany przy użyciu gradientów jodiksanolu z filtracją wspomaganą kopolimerem blokowym.

Protokół

1. Transfekcja komórek HEK293 plazmidami rekombinowanego wirusa towarzyszącego adenowirusom 9 (rAAV9)
   1. Przygotować roztwór liniowej polietylenoiny (PEI) o stężeniu 1 µg/µl. Proszek PEI rozpuścić w wodzie dH₂O wolnej od endotoksyn, podgrzanej do 70-80 °C. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej (RT) zneutralizować roztwór do pH 7,0 za pomocą 1 M kwasu solnego (HCl). Roztwór wysterylizować za pomocą filtracji (0,22 µm). Rozdzielić roztwór stokowy PEI 1 µg/µl na aalikwoty (1400 µl/probówka) i przechowywać w temperaturze -20 °C.
   2. Hodować komórki HEK293 w podłożu DMEM (Dulbecco's Modifi....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Polyethylenimin, liniowy (MW 25,000)	Polysciences, Inc.	#23966-2
Probówka, polipropylenowa, 36.2 ml, 25 x 87 mm, (ilość 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
Nukleaza, ultrapure	SIGMA	#E8263-25KU
Medium do gradientu gęstości (jodiksanol)	SIGMA	#D1556-250ML
Odwirnik filtracyjny z membraną Ultracel-100	EMD Millipore Corporation	#UFC910008
Laboratoryjna igła pipetująca z tępym zakończeniem 90°, rozmiar 14, L 6 in., z niklowanym piastą	SIGMA	#CAD7942-12EA
Roztwór poloksameru 188 (roztwór Pluronic® F-68)	SIGMA	P5556-100ML
Proteinaza K	SIGMA	3115828001
DNaza I	Roche	10104159001
Wirówka	Thermo Scientific	75004260
System wirówkowy	Beckman Coulter	363118
Ultrawirówka	Beckman Coulter
Pożywka DMEM	Fisher Scientific	SH30243FS
Pł TkŁ (płódwołowa surowica)	Atlanta Biologicals	S11150
Wektor rAAV9	Penn Vector Core	P1967