Transdukcja komórek śródbłonka (EC) genami E6 i E7 papilomawirusa UWAGA: Do hodowli pierwotnych komórek EC rutynowo stosujemy standardowe kolby do hodowli tkanek. Jeśli jednak wzrost komórek EC jest niezadowalający, należy rozważyć zastosowanie komercyjnych kolb hodowlanych. Hodować pierwotne ludzkie mikro naczyniowe lub limfatyczne komórki EC w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w pożywce wzrostowej EC (EGM; zawiera podstawową pożywkę EC [EBM] uzupełnioną o EGM-2 BulletKit [zawierający płodową surowicę wołową, hydrokortyzon, ludzki czynnik wzrostu fibroblastów-B, czynnik wzrostu naczyniowego EC, insulinopodobny czynnik wzrostu-1, kwas askorbinowy, ludzki czynnik wzrostu nabłonka, antybiotyki i heparynę]) w kolbie hodowlanej T75 do osiągnięcia konfluencji na poziomie około 50%. Do transdukcji hodować komórki PA317 LXSN 16E6E7 w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w pożywce Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) uzupełnionej o 10% płodowej surowicy wołowej i środki przeciwdrobnoustrojowe w kolbie hodowlanej T150, aż do osiągnięcia konfluencji na poziomie około 90%. Następnie inkubować przez noc w 16 ml pożywki. Klarować pożywkę z komórkami PA317 poprzez wirowanie przy 300 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Usunąć pożywkę EGM z hodowli EC i zalać komórki 12 ml sklarowanej pożywki PA317, a następnie inkubować przez 4 h. UWAGA: Wirowanie 16 ml pożywki warunkowanej przy 300 × g przez 5 min prowadzi do powstania zwartego osadu, który nie zostaje naruszony podczas ostrożnego późniejszego pobrania 12 ml sklarowanego supernatantu. Jeśli jednak istnieje obawa przed przeniesieniem komórek PA317 LXSN 16E6E7 do pierwotnych hodowli EC (linia komórek pakujących szybko zdominuje wzrost EC), przed przeniesieniem można przeprowadzić filtrację warunkowanego supernatantu przez filtr 0,45 µm. Zastąpić 6 ml pożywki PA317 świeżą pożywką EGM i inkubować przez noc. Dodać do komórek EC 12 ml świeżej pożywki EGM i inkubować przez kolejne 48 h. Aby przeprowadzić pasaż komórek EC, usunąć pożywkę i przemyć 12 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) bez kationów, dodać 3 ml komercyjnego roztworu do dysocjacji enzymatycznej (np. TrypLE) i inkubować w 37 °C przez 3 min. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki stożkowej 15 ml i wirować przy 300 × g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Powstały osad komórkowy resuspendować w świeżej pożywce EGM i podzielić równomiernie do 3 kolb T75, tak aby finalna objętość EGM wynosiła 12 ml na kolbę. Aby wyselekcjonować komórki EC transdukowane genami E6 i E7, dodać G418 do stężenia końcowego 200 µg/ml przez dwa pasaże, po czym transdukowane komórki EC można wysiać do infekcji lub zamrozić w ciekłym azocie. McAllister, S. C., Hanson, R. S., i wsp. Model in vitro do badania transformacji komórkowej wywołanej przez wirusa herpes typu związanego z ziarniaczakiem Kaposiego. J. Vis. Exp.(2017)
W niniejszym filmie zaprezentowano transdukcję retrowirusową pierwotnych komórek śródbłonka za pomocą onkogenów E6/E7 HPV16. Zintegrowane onkogeny inaktywują supresory nowotworowe p53 i Rb, co wydłuża żywotność komórek. Selekcja za pomocą G418 pozwala na wzbogacenie populacji o komórki transdukowane, co prowadzi do uzyskania unieśmiertelnionych kultur śródbłonka odpowiednich do badań nad transformacją
