Oznaczanie rozmieszczenia wirusowego RNA w komórkach gospodarza za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Streszczenie

Źródło: Vallery, T. K. & Steitz, J. A. Quantitative Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and Immunofluorescence (IF) of Specific Gene Products in KSHV-Infected Cells. J. Vis. Exp. (2019)

Niniejszy film demonstruje metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu wizualizacji wirusowego RNA w komórkach zainfekowanych wirusem. Przedstawia on etapy związane z hybrydyzacją sond, amplifikacją sygnału oraz obrazowaniem konfokalnym.

Protokół

1. Fixacja, hybrydyzacja i wizualizacja wirusowych RNA

1. Usunąć medium oraz nadmiar komórek. W całym protokole do usuwania roztworów należy używać ssania próżniowego, a do dodawania roztworów delikatnego mikropipetowania.
   UWAGA: Siłę ssania można zmniejszyć, nakładając końcówkę mikropipety 200 µL na szklaną pipetę Pasteura. Końcówkę mikropipety należy wymieniać pomiędzy etapami płukania, aby zapobiec kontaminacji. Każdy etap płukania musi być przeprowadzony szybko, ponieważ kluczowe jest, aby komórki nigdy nie wyschły.
2. Niezwłocznie utrwalić komórki schłodzonym do 4 °C 4% formaldehydem w PBS (buforze fosforanowym) przez 30 min na lodzie. Przepłukać komórki trzy razy 200 µL 1x PBS schłodzonego do 4 °C i inkubować przez 5 min w temperaturze pokojowej lub na lodzie.
   1. Przeprowadzić permeabilizację utrwalonych komórek za pomocą 200 µL schłodzonego 0,5% Tritonu-X w PBS przez 10 min na lodzie lub 750 µL schłodzonego 70% etanolu w 4 °C od 1 h (minimum) do 7 d (maksimum).
      UWAGA: Wszystkie etapy płukania w tym protokole wykonuje się w ten sam sposób, chyba że określono inaczej. 70% etanol rozluźnia klej między komorami a szkiełkiem, co ułatwia późniejszą separację, a także umożliwia znaczną przerwę w protokole. Należy jednak użyć folii parafinowej wokół szkiełka z komorami, aby ograniczyć parowanie i sprawdzać poziom etanolu w każdej komorze mniej więcej co 8 h. 70% etanol spłaszcza również komórki, co daje ostrzejszy obraz, podczas gdy Triton-X nie odwadnia komórek i nie zmienia ich wymiarów.
3. Ostrożnie usunąć komory, aby zapobiec pęknięciu szkiełka.
   UWAGA: Należy użyć nowego urządzenia do usuwania lub takiego, na którym pozostało bardzo mało kleju dostarczonego przez producenta, i delikatnie zdjąć komory, aby zapobiec pęknięciu szkiełka. Użycie 70% etanolu jako odczynnika do permeabilizacji przez 4 h znacznie zmniejsza prawdopodobieństwo pęknięcia. W przypadku pęknięcia kontynuować protokół w komorach nieobjętych pęknięciem i pamiętać o wyższym tempie utleniania w niedokładnie uszczelnionych szkiełkach (tzn. krótszym czasie przechowywania).
4. Przepłukać komórki raz 2x SSC (cytrynianem sodu w roztworze soli), a następnie nanieść 45 µL roztworu do hybrydyzacji składającego się z 50% formamidu, 10% siarczanu dekstranu, 2x SSC, 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 500 µg/mL DNA sperm plemniaczych łososia, 125 µg/mL tRNA z E. coli oraz 1 mM kompleksów wanadylu z rybonukleozydem. Inkubować przez 1 h w 37 °C w komorze wilgotnościowej, którą może być szalka Petriego 150 mm z nawilżonymi sterylnymi chusteczkami.
   UWAGA: Świeży roztwór do hybrydyzacji należy przygotować co najmniej godzinę przed użyciem. Siarczan dekstranu rozpuścić najpierw w wodzie, często mieszając w vortexie i inkubując w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
5. Obliczyć ilość oligonukleotydów potrzebną do uzyskania sugerowanego stężenia 25 µM w 35 µL roztworu do hybrydyzacji na komorę. Dostosować stężenie oligonukleotydu antysensownego w razie potrzeby. Dodać wodę destylowaną do oligonukleotydów, aby objętość do denaturacji wyniosła 10 µL.
   UWAGA: Po reakcji znakowania oligonukleotydy przechowuje się w roztworze gaszącym zawierającym 0,18 M kacodylan potasu, 23 mM Tris-HCl, 0,23 mg/mL BSA, 4,5 mM CoCl₂, 18 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), 2,7 mM fosforan potasu, 6,8 mM KCl, 45 µM 2-merkaptoetanol, 0,02% Triton X-100 i 2% glicerolu. Stężenia są na tyle wysokie, że rozcieńczenie wodą doprowadzi roztwór denaturujący do stężeń bliskich 1x TE (10 mM Tris-HCl i 1 mM EDTA), standardowego buforu do denaturacji oligonukleotydów.
6. Zdenaturować oligonukleotydy znakowane digoksigeniną (DIG) i/lub Alexa Fluor 594 w 95 °C przez 5 min. Następnie dodać 35 µL świeżego roztworu do hybrydyzacji na każdą planowaną komorę do zdenaturowanych oligonukleotydów. W przypadku przeprowadzania podwójnej hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej (FISH), oba zestawy oligonukleotydów antysensownych można denaturować i hybrydyzować razem.
7. Usunąć roztwór do prehybrydyzacji, a następnie nanieść na komórki roztwór do hybrydyzacji zawierający znakowane oligonukleotydy. Inkubować przez noc w komorze wilgotnościowej w 37 °C, zabezpieczając folią aluminiową, aby chronić oligonukleotydy znakowane fluoroforami.
   UWAGA: Inkubacja powinna trwać co najmniej 10 h i nie więcej niż 24 h.
8. Następnego dnia przepłukać komórki dwa razy 2x SSC przez 10 min w 37 °C, a następnie dwa razy 1x SSC przez 10 min w 25 °C.
9. Utrwalić komórki schłodzonym 4% formaldehydem w 1x PBS przez 10-15 min na lodzie. Następnie przepłukać komórki trzy razy PBS i przeprowadzić permeabilizację przez 1 h schłodzonym 70% etanolem lub przez 10 min schłodzonym 0,5% Tritonem-X w 1x PBS w 4 °C.
10. Inkubować komórki z przeciwciałem anty-digoksigenina (DIG)–izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) w rozcieńczeniu 1:200 w schłodzonym 0,1% BSA/1x PBS przez 1 h w 4 °C. Usunąć roztwór przeciwciał i przepłukać trzy razy 1x PBS.
11. Utrwalić schłodzonym 4% formaldehydem w 1x PBS przez 10-15 min w 4 °C, a następnie przepłukać trzy razy 1x PBS.
12. Inkubować komórki z 0,4 µg/mL 4′,6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI) w schłodzonym 0,5% Tritonie-X w 1x PBS przez 15 min na lodzie, a następnie przepłukać trzy razy 1x PBS.
13. Zamontować szkiełka z użyciem kulek fluorescencyjnych (opcjonalnie) i medium montującego. Następnie przykleić szkiełko nakrywkowe do szkiełka przedmiotowego za pomocą bezbarwnego laku do paznokci.
14. Używając mikroskopu konfokalnego, zebrać obrazy próbek od godziny do tygodnia po wykonaniu protokołu przy powiększeniu 630x. Nanieść kilka warstw laku do paznokci, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe i przedłużyć żywotność fluoroforów poprzez ograniczenie tempa utleniania.
    UWAGA: Nie używać medium montującego zawierającego DAPI. Podczas zbierania obrazów należy dodać pasek skali do każdego zdjęcia w celu późniejszej kwantyfikacji. Kuleczki fluorescencyjne służą jako kontrole intensywności fluorescencji między szkiełkami a preparatami próbek. Obrazy należy pozyskiwać z przekroju środkowego komórki do kwantyfikacji dwuwymiarowej (2D).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Anti-DIG FITC	Jackson Lab Immunologicals	200-092-156
Siarczan dekstranu	Sigma Aldrich	D8906	Klasa do biologii molekularnej
Zestaw do ogonowania oligonukleotydów DIG	Sigma Roche	#03353583910	2nd Gen
Szkiełka ośmiokomorowe	Nunc Lab Tek II	#154453	Niebieska uszczelka zwiększa napięcie powierzchniowe, ale dostępna jest również wersja z oddzieleniem przez przezroczysty żel.
Formamid	Sigma Aldrich	F9037	Klasa do biologii molekularnej
Kompleksy wanadylu z rybonukleozydami	NEB	S1402S