Pomiar spontanicznej indukcji fagów w bakteriach lizogennych w czasie

Streszczenie

Źródło: Krishnamurthi, R., et al. Understanding the Impact of Temperate Bacteriophages on Their Lysogens Through Transcriptomics. J. Vis. Exp. (2024).

Niniejszy film prezentuje czasowe oznaczanie liczby spontanicznej indukcji fagowej w lizogennych szczepach Pseudomonas aeruginosa poprzez ilościowe określenie liczby żywych komórek bakteryjnych (CFU) oraz zakaźnych cząstek fagowych (PFU) w czasie. Dzięki pobieraniu próbek w określonych odstępach czasu podczas wzrostu oraz analizie tworzenia kolonii i placków, metoda ta pozwala określić, kiedy indukcja spontaniczna jest minimalna. Umożliwia to identyfikację optymalnych punktów czasowych dla późniejszych analiz transkryptomicznych przy minimalnym zakłóceniu cyklem litycznym.

Protokół

1. Czasowa bezpośrednia enumeracja indukcji spontanicznej (Rycina 1)

1. Przygotować nocne kultury startowe lizogenu (np. lizogenu P. aeruginosa PAO1 zawierającego fagi LES (bakteriofagi szczepu epidemicznego z Liverpoolu (LES))) oraz gospodarza wskaźnikowego (PAO1-Rif^R) (opornego na ryfampicynę Pseudomonas aeruginosa PAO1), szczepiąc pojedynczą kolonię w 5 mL bulionu LB (Luria–Bertani), a następnie inkubować w 37 °C przy wstrząsaniu z prędkością 180 rpm (18–24 h).
2. Przygotować świeże kultury lizogenu i gospodarza wskaźnikowego, szczepiąc kultury nocne w 100 mL LB w stosunku 1:100, i inkubować w 37 °C przy wstrząsaniu (180 rpm).
   1. Monitorować wzrost lizogenu poprzez pomiar OD₆₀₀ oraz liczbę komórek żywotnych z wykorzystaniem metody Milesa i Misry. W tym celu pobierać 1 mL próbki z każdej kultury lizogenu co godzinę, począwszy od momentu szczepienia, przez okres 8 h.
   2. Próbkę rozcieńczać seryjnie bezpośrednio po pobraniu, dodając 100 µL próbki do 900 µL odpowiedniego medium. Intensywnie mieszać na wirówce typu vortex z maksymalną prędkością, wymieniać końcówkę przy każdym rozcieńczeniu i kontynuować serię rozcieńczeń od 10⁻¹ do 10⁻⁹.
   3. Nanieść po 10 µL wymaganych rozcieńczeń w trzech powtórzeniach na płytkę z agarem LB, pozwolić wyschnąć i inkubować w 37 °C przez 18–24 h.

   4. Aby obliczyć liczbę żywotnych komórek bakteryjnych, należy znaleźć rozcieńczenie z łatwo policzalnymi koloniami. Policzyć liczbę kolonii w każdej plamce, a następnie zastosować następujący wzór:
       

      

      
      UWAGA: W miarę wzrostu kultury lizogenu w wyniku indukcji spontanicznej będą powstawać aktywne cząstki fagów. Produkcja zakaźnych fagów oznacza, że transkryptom populacji lizogennej jest obecnie zanieczyszczony ekspresją genów związanych z litycznym cyklem replikacyjnym, wynikającą z sygnału replikacji litycznego faga i odpowiadającej mu odpowiedzi komórki gospodarza. Dlatego ważne jest zidentyfikowanie stadium wzrostu, w którym stosunek komórek lizogennych do wolnych zakaźnych cząstek fagów jest najwyższy, aby w maksymalnym stopniu ograniczyć szum transkrypcyjny w tle (generowany przez transkryptom litycznego faga) w zbiorze danych.

3. Aby określić liczbę zakaźnych cząstek fagów w każdej próbce czasowej, zaszczepić 5 mL sterylnego 0,4% agaru bakteriologicznego w LB (agar wierzchni) 100 µL gospodarza wskaźnikowego w średniej fazie wykładniczej (OD600: 0,4–0,5; w tym przypadku PAO1-Rif^R) w obecności odpowiedniego czynnika selekcyjnego (w tym przypadku 50 µg·mL⁻¹ ryfampicyny, ponieważ MIC dla gospodarza PAO1 wynosi tylko 16 µg·mL⁻¹)
   1. Nanieść 10 µL tego samego rozcieńczenia seryjnego (patrz krok 1.2.2) na zaszczepioną warstwę agaru wierzchniego, pozwolić wyschnąć, a następnie inkubować w 37 °C przez 18–24 h.

   2. Aby obliczyć liczbę zakaźnych cząstek fagów, należy znaleźć rozcieńczenie z łatwo policzalnymi plakami. Policzyć liczbę plaków w każdej plamce.
       

      

   3. Wyznaczyć czas/warunki, dla których indukcja spontaniczna na CFU (jednostkę tworzącą kolonię) jest minimalna, do dalszych etapów eksperymentalnych.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat doświadczalny oznaczania PFU i CFU lizogenu z tej samej próbki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PAO1		6
LESB58		6
Fagi LES	Indukowane i oczyszczone z LESB58 przy użyciu norfloksacyny.
Pożywka LB (Lysogeny Broth)	Merck	1.10285.500
Agar LB	Merck	1.10283.500
Agar-agar	Fisher	A/1080/53
Top Agar	0.4 g agar-agaru + 2.5 g pożywki LB w 100 mL wody; autoklawować i użyć.	-
Rifampicyna	Sigma (roztwór stokowy: 50 mg/mL w metanolu – dobrze wymieszać, wysterylizować za pomocą filtra 0.22µm i przechowywać w -20°C do czasu użycia)	R3501