W tym filmie zaprezentowano indukcję replikacji litycznej profaga zintegrowanego z genomem bakteryjnym oraz rejestrację zmian w ekspresji genów poprzez pobieranie próbek w określonych odstępach czasu do analizy transkryptomicznej.
Artykuł metodologiczny
Indukcja replikacji litycznej profaga do analizy transkryptomicznej
10 wyświetleń
⸱
30 września 2026
W tym artykule
Streszczenie
Protokół
1 . Przygotowanie nieindukowanych i indukowanych kultur lizogenów do ekstrakcji RNA (kwasu rybonukleinowego)
- Przygotować świeżą kulturę nocną, szczepiąc pojedynczą kolonię lizogenu w 5 mL LB, a następnie inkubować w 37 °C z wytrząsaniem (180 rpm (obrotów na minutę)) przez 18–24 h.
- Przeszczepić kulturę nocną do 80 mL LB (pożywka LB) w stosunku 1:100 do ośmiu kolb o pojemności 250 mL.
- Pierwszą kolbę oznaczyć jako „nieindukowaną”, a pozostałe jako „indukowane”, podając punkty czasowe, w których należy zebrać każdą próbkę (np. „indukowana t = 0”, „indukowana t = 10 min”, „indukowana t = 20 min” itd.; (Rycina 1).
- Po 90 min inkubacji, gdy OD (gęstość optyczna) 600 wynosi od 0,1 do 0,2 lub w czasie minimalnej indukcji spontanicznej (patrz dyskusja), dodać 4 µL 1% lodowatego kwasu octowego (v/v) do kolby nieindukowanej (Rycina 1).
UWAGA: Ponieważ czynnik indukujący w tej pracy został przygotowany z użyciem 1% lodowatego kwasu octowego jako rozpuszczalnika, w kroku kontrolnym dodano sam rozpuszczalnik w tej samej ilości. W zależności od przygotowania różnych induktorów można rozważyć alternatywne kontrole. - Przenieść 80 mL kultury z kolby nieindukowanej do 720 mL sterylnego LB i natychmiast dodać roztwór zatrzymujący (lodowaty 5% [v/v] fenol, pH 4,3, 95% [v/v] etanol) w objętości stanowiącej 20% objętości kultury (160 mL), a następnie inkubować na lodzie przez minimum 30 min, nie dłużej niż 2 h, aby ustabilizować transkrypty RNA. Jest to próbka nieindukowana.
- Indukować pozostałe kultury w siedmiu kolbach o pojemności 250 mL (Rycina 1) przy użyciu FMIC (końcowego minimalnego stężenia hamującego) odpowiedniego czynnika indukującego (w tym przypadku 25 mg·mL−1 norfloksacyny przygotowanej w 1% lodowatym kwasie octowym [w/v], użytej w końcowym stężeniu 1 µg·mL−1), dobrze wymieszać i inkubować w 37 °C z wytrząsaniem przy 180 rpm przez 1 h.
UWAGA: Ten krok wprowadzi kulturę lizogenu w bardziej skoordynowany stan replikacji litycznej. Większość komórek w kulturze zacznie litycznie produkować zakaźne cząsteczki fagów. - Umożliwić regenerację komórek, dodając 80 mL kultury z kolby indukowanej do 720 mL sterylnego LB, co skutecznie rozcieńczy czynnik indukujący. Zbierać komórki bakteryjne z każdej kolby co 10 min od czasu 0 do 1 h, dodając roztwór zatrzymujący, jak opisano w kroku 1.5.
UWAGA: Roztwór zatrzymujący stabilizuje RNA do 2 h. Jednak w celu zwiększenia stabilności próbek wszystkie kolejne kroki należy przeprowadzać w 4 °C. - Zebrać komórki poprzez wirowanie przy 10 000 x g przez 15 min w 4 °C tak szybko, jak to możliwe, nie przekraczając 2 h po obróbce, aby uniknąć degradacji RNA.
- Odlać nadosad, a osady bakteryjne delikatnie resuspendować w pozostałej cieczy za pomocą regulowanej pipety automatycznej przed przeniesieniem każdej próbki do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
- Wirować probówki w mikrowirówce z dużą prędkością (13 000 x g) w 4 °C przez 1 min, a następnie odlać pozostały nadosad.
- Szybko zamrozić osady, zanurzając każdą zamkniętą probówkę w ciekłym azocie. Ułatwi to wydajną lizę komórek podczas ekstrakcji RNA.
- Dodać TRIzol (1 mL) do każdego zamrożonego osadu i homogenizować zawiesinę poprzez pipetowanie (nie używać wirówki wortex). Przechowywać w −80 °C do momentu przeprowadzenia ekstrakcji RNA dla wszystkich próbek.
UWAGA: Na tym etapie można przerwać protokół. - Powtórzyć kroki 1.1–1.13 w trzech powtórzeniach biologicznych.
Wyniki
Rysunek 1: Schemat doświadczalny pobierania próbek z kultur indukowanych i nieindukowanych do izolacji RNA.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Fagi LES | Indukowane i oczyszczone z LESB58 przy użyciu norfloksacyny. | Niniejsze badanie | |
| Pożywka LB (Lysogeny Broth) | Merck | 1.10285.500 | |
| Agar LB (Lysogeny Broth Agar) | Merck | 1.10283.500 | |
| Agar-agar | Fisher | A/1080/53 | |
| Agar wierzchni (Top Agar) | 0,4 g agaru-agaru + 2,5 g pożywki LB w 100 mL wody; autoklawować i użyć. | - | |
| Rifampicyna | Sigma (Roztwór zapasowy: 50 mg/mL w metanolu – dobrze wymieszać, wysterylizować za pomocą filtra 0,22 µm i przechowywać w -20 °C do momentu użycia) | R3501 | |
| Kwas octowy lodowaty | Fisher 1% (v/v) w wodzie | 10060000 | |
| Norfloksacyna | Sigma (Roztwór zapasowy: 25 mg/mL w 1% kwasie octowym lodowatym – dobrze wymieszać, wysterylizować za pomocą filtra 0,22 µm i przechowywać w -20 °C do momentu użycia; aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania, przechowywać w postaci małych aliquotów) | N9890 | |
| Fenol nasycony buforem cytrynianowym pH 4,3 | Sigma | P-4682 | |
| Etanol klasy biologii molekularnej | Fisher | 16695992 | |
| TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
| Chloroform | Fisher | 11398187 | |
| Izopropanol | Fisher | 17150576 | |
| Woda wolna od nukleaz | Invitrogen | 10526945 |
