Pozyskiwanie wirusa towarzyszącego adenowirusom z przetransfekowanych komórek ssaków

Streszczenie

Źródło: Rghei, A. D., et al. Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models. J. Vis. Exp. (2021)

W niniejszym filmie zaprezentowano metodę odzyskiwania surowego wirusa towarzyszącego adenowirusom z przetransfekowanych komórek ssaków z wykorzystaniem lizy chemicznej i wirowania, co umożliwia wysokowydajną produkcję AAV na potrzeby dalszego oczyszczania i przedklinicznych zastosowań w terapii genowej.

Protokół

1. Pozyskiwanie AAV (wirusa adeno-zależnego) i lizy chemicznej przetransfekowanych komórek HEK293 (ludzkiej linii embrionalnej nerki 293)

1. Energicznie potrząśnij komorą hodowli komórkowej, aby odrywać komórki, aż pożywka stanie się mętna od oderwanych komórek, a następnie przelej zawartość do czterech probówek wirówkowych o pojemności 50 mL.
2. Wiruj probówki przy 18 0 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C, aby wytrącić komórki w osad. Przelej oczyszzczony nadsącz do butelki z kopoliestru polietylenotereftalanowego (PETG) o pojemności 1 L.UWAGA: W przypadku braku dostępu do wirówki wysokoprędkościowej, wiruj przy 12 0 x g przez 40 min. Przy tej prędkości osad komórkowy może nie być zwarty i może przemieszczać się podczas zlewania nadsączu.
3. Resuspenduj osady komórkowe w probówkach wirówkowych 50 mL w 50 mL buforu do lizy i inkubuj przez 60 min w temperaturze 37 °C.
4. Wiruj probówki przy 18 00 x g przez 30 min, a następnie przenieś nadsącz do tej samej butelki PETG 1 L. Usuń osad z pozostałości komórkowych.UWAGA: Oczyszczony nadsącz należy poddać puryfikacji niezwłocznie lub przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 72 h. Do dłuższego przechowywania używaj temperatury -80 °C. Nie przechowywać w -20 °C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10-komorowy cellstack	Corning	3271
Butelka 1 L z PETG	Thermo Fisher Scientific	2019-10
Podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) z 100 mg/L D-glukozą i L-glutaminą	Cytiva Life Sciences	SH302.01
Płódkowa surowica bydlęca (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
Komórki HEK293	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	Po otrzymaniu rozmrozić komórki i hodować zgodnie z protokołem producenta. Gdy komórki przejdą minimalną liczbę pasaży i będą dobrze rosły, zamrozić podfrakcję w alikwotach na przyszłość i przechowywać w ciekłym azocie. Należy zawsze używać komórek o numerze pasażu poniżej 30. Po przekroczeniu 30 pasaży zaleca się rozpoczęcie nowej hodowli z przechowywanych alikwotów
Podkładka wspierająca do wirówek o dużej objętości	Corning	CLS431124	Podkładkę wspierającą należy stosować z probówkami wirówkowymi o dużej objętości, chyba że rotor wirówki posiada odpowiednie podkładki w kształcie litery V
Probówki wirówkowe o dużej objętości	Corning	CLS43123-6EA	Probówki wirówkowe 50 mL