Oczyszczanie wektorów wirusów towarzyszących adenowirusom z wykorzystaniem chromatografii powinowactwa

Streszczenie

Źródło: Rghei, A. D., et al. Production of Adeno-Associated Virus Vectors in Cell Stacks for Preclinical Studies in Large Animal Models. J. Vis. Exp. (2021)

Wideo przedstawia oczyszczanie wektorów rekombinowanego wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV) z surowego lizatu gospodarza przy użyciu macierzy powinowactwa opartej na heparynie. Cząsteczki wirusowe wiążą się z unieruchomioną heparyną, podczas gdy zanieczyszczenia są wypłukiwane. Bufor o wysokim stężeniu soli uwalnia nienaruszone wirusy, które są zbierane w postaci wzbogaconych frakcji. Frakcje te są zagęszczane poprzez wirowanie membranowe i płukane w celu odzyskania pozostałych cząsteczek, co pozwala na uzyskanie oczyszczonych wektorów AAV o wysokim mianie.

Protokół

1. Transfekcja podwójna plazmidowa komórek HEK293 w stosach komórkowych

1. Rozmroź krioampułkę z komórkami ludzkiej embrionalnej nerki 293 (HEK293) w łaźni kulkowej ustawionej na 37 °C.
   UWAGA: W czasie rozmrażania komórek wstępnie ogrzej pełną pożywkę Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) do 37 °C, aby zapobiec szokowi termicznemu podczas wysiewania. Upewnij się, że komórki mają niski numer pasażu, idealnie poniżej 20, aby zapewnić optymalny wzrost i wydajność transfekcji. Upewnij się, że komórki posiadają certyfikat braku mykoplazmy.
2. Przenieś zawartość krioampułki kroplami do probówki stożkowej 15 mL zawierającej 10 mL wstępnie ogrzanej pełnej pożywki DMEM i odwiruj komórki przy 500 × g przez 5 min.
3. Odsaj cały medium, a następnie resuspenduj komórki HEK293 w 20 mL wstępnie ogrzanej pełnej pożywki DMEM. Wysiej komórki na płytkę 15 cm i inkubuj w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂.
4. Podziel komórki z jednej płytki 15 cm na trzy w celu wysiania w komorze do hodowli komórkowej.
   1. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, odsaj medium i delikatnie przemyj płytkę 3 mL roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), aby nie uszkodzić monowarstwy. Następnie odsaj PBS i dodaj 3 mL trypsyny.
   2. Inkubuj przez 2 min w 37 °C, aż komórki odkleją się od płytki, a następnie zneutralizuj trypsynę, dodając do płytki 7 mL pełnej pożywki DMEM.
   3. Zbierz całe medium wraz z komórkami do probówki 15 mL i zgranuluj komórki poprzez wirowanie przy 500 × g przez 5 min.
   4. Odsaj nadsącz z probówki 15 mL i resuspenduj pellet komórkowy w 3 mL pełnej pożywki DMEM. Dodaj 1 mL do każdej płytki 15 cm zawierającej 20 mL pełnej pożywki DMEM; delikatnie kołysz płytkami, aby równomiernie rozłożyć komórki, i inkubuj w 37 °C przy 5% CO₂.
5. Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, powtórz kroki 1.4.1 i 1.4.2. Zbierz nadsącz do probówek stożkowych 50 mL i delikatnie odwróć probówkę, aby zapewnić homogeniczność zawiesiny komórkowej.
6. Wyznacz gęstość komórek, mieszając 10 µL próbek komórek z 10 µL błękitu trypanu i nanosząc mieszaninę na szkiełko do liczenia komórek w celu analizy w liczniku komórek.
7. Wymieszaj 1 L wstępnie ogrzanej pełnej pożywki DMEM z wymaganą zawiesiną komórkową, aby wysiać komorę do hodowli komórkowej (powierzchnia 6360 cm²) z gęstością 1 × 10⁴ komórek/cm². Wlej mieszaninę komórkową do komory do hodowli komórkowej i delikatnie obracaj, aby równomiernie rozłożyć komórki w każdej monowarstwie (Rysunek 1), a następnie inkubuj w 37 °C przy 5% CO₂.
8. Oprócz komory do hodowli komórkowej, wysiej płytkę 15 cm z gęstością 1 × 10⁴ komórek/cm² jako referencję konfluencji.
9. Po ok. 65-godzinnej inkubacji sprawdź konfluencję na płytce referencyjnej – idealnie powinna wynosić ok. 80%-90%.
   UWAGA: Wstępnie ogrzej pełną pożywkę DMEM do temperatury 37 °C przed dodaniem jej do komory do hodowli komórkowej.
10. Przygotuj mieszaninę polietylenoiminy (PEI)/DNA w stosunku stężeń 3:1 (w/w).
    1. Przygotuj mieszaninę DNA w probówce stożkowej 50 mL, dodając 475 µg pTrangene i 1425 µg pHelper do 40 mL pożywki z obniżoną zawartością surowicy, aby uzyskać stosunek pHelper:pTrangene wynoszący 3:1.
       UWAGA: Kalkulator mieszaniny PEI/DNA znajduje się w Tabeli 1.

Transfekcja komór w komorze hodowlanej
Protokół
1. Przed transfekcją doprowadzić DNA, OptiMEM oraz PEI do temperatury pokojowej
2. Wprowadź liczbę stosów komórkowych do transfekcji (nadwyżka nie jest wymagana)
3. Należy upewnić się, że stężenia DNA są prawidłowe, ponieważ wpłynie to na wymagane objętości
Liczba komór hodowli komórkowej		1
Koncentracja plazmidu transgenu		1	mg/ml
Koncentracja plazmidu pDGM6.2FF		1	mg/ml
		Ilość na komory hodowli komórkowej		Mieszanina główna do transfekcji
	OptiMEM	48.1	ml	48.1	ml
stosunek 1:3 pTransgene:pHelper	pTransgen	475	µg	475	µL
	pHelper	1425	µg	1425	µL
4. Do probówki stożkowej o pojemności 50 mL dodać wymagane objętości OptiMEM oraz plazmidowego DNA
5. Odwrócić probówkę 10 razy w celu wymieszania zawartości
stosunek PEI do DNA 3:1	PEI Max	5.7	ml	5.7	ml
6. Do probówki o pojemności 50 ml zawierającej OptiMEM i plazmidowe DNA dodać wymaganą ilość PEI
7. Natychmiast zamknąć probówkę 50 ml, a następnie wymieszać zawartość, mieszając w wirówce typu vortex i odwracając probówkę 3–5 razy.
8. Ustawić minutnik na 10 min w celu inkubacji kompleksów PEI
9. Przenieść stosy komórek przeznaczone do transfekcji do komory bezpieczeństwa biologicznego (BSC)
10. Po 10 min wlej mieszaninę do transfekcji przez jeden z pomarańczowych portów.
11. Delikatnie wymieszaj ciecz w całym stosie komórek
12. Umieść stos z transfekowanymi komórkami z powrotem w inkubatorze, upewniając się, że na każdej warstwie znajduje się taka sama objętość cieczy.
13. Po 72 h zebrać zawartość komory hodowli komórkowej

Tabela 1: Kalkulator transfekcji dla komory hodowli komórkowej. Interaktywny arkusz służący do wyznaczenia prawidłowego stężenia pTransgene, pHelper oraz PEI do transfekcji komory hodowli komórkowej.

2. Do pożywki z obniżoną zawartością surowicy oraz mieszaniny DNA dodać kroplami 5,7 mL PEI (1 g/L). Następnie krótko wymieszać w wirówce typu vortex i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Podczas inkubacji PEI/DNA w temperaturze pokojowej roztwór stanie się lekko mętny.

11. Po 8 min inkubacji PEI/DNA usunąć medium z komory hodowli komórkowej.
    UWAGA: Należy poluzować obie pomarańczowe zakrętki, aby zapewnić płynny przepływ medium i uniknąć odrywania się komórek.
12. Dodać PEI/DNA do 1 L uprzednio ogrzanego pełnego DMEM i powoli wlać mieszaninę przez port komory hodowli komórkowej. Równomiernie rozprowadzić płyn we wszystkich rzędach (Rycina 1) i inkubować przez 72 h w temperaturze 37 °C, przy 5% CO₂.

2 Pozyskiwanie wirusa towarzyszącego adenowirusom (AAV) i lizą chemiczna transfektowanych komórek HEK293

1. Energicznie wstrząśnij komorą hodowli komórkowej, aby oderwać komórki, aż pożywka stanie się mętna od uwolnionych komórek, a następnie przelej zawartość do czterech probówek wirówkowych o pojemności 500 mL.
2. Wiruj probówki przy 18,000 × g przez 30 min w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad komórkowy. Przelej klarowny nadsącz do butelki z kopoliestru polietyleno tereftalowego (PETG) o pojemności 1 L.
   UWAGA: W przypadku braku dostępu do wirówki wysokich obrotów, wiruj przy 12,000 × g przez 40 min. Przy tej prędkości osad komórkowy może nie być zwarty i może przesuwać się podczas znikania nadsączu.
3. Resuspenduj osady komórkowe w probówkach wirówkowych o pojemności 500 mL w 50 mL buforu do lizy i inkubuj przez 60 min w temperaturze 37 °C.
4. Wiruj probówki przy 18,000 × g przez 30 min, a następnie przenieś nadsącz do tej samej butelki PETG o pojemności 1 L. Odrzuć osad z debris komórkowych.
   UWAGA: Oczyść klarowny nadsącz niezwłocznie lub przechowuj w temperaturze 4 °C do 72 h. W przypadku dłuższego przechowywania, przechowuj w temperaturze -80 °C. Nie przechowywać w temperaturze -20 °C.

3 Oczyszczanie wektorów AAV przy użyciu chromatografii powinowactwa do heparyny

1. Wyjąć surowy lizat z temperatury -80 °C i pozostawić w 4 °C przez noc w celu rozmrożenia. Po rozmrożeniu przefiltrować surowy lizat za pomocą filtra 0,22 µM.
2. Aby spasywować koncentrator wirówkowy, dodać 4 mL buforu do wstępnego przygotowania filtra do koncentratora wirówkowego dla każdej używanej kolumny heparin sepharose. Pasywować koncentrator wirówkowy w temperaturze pokojowej przez 2-8 h. Pasywację przeprowadzić bezpośrednio przed etapami oczyszczania.
3. Przygotować przewody i pompę (Rysunek 2).
   1. Umieścić przewody w pompie perystaltycznej i przepuścić 20 mL 1 M NaOH. Następnie przepuścić 50 mL wody czystości molekularnej, a potem 50 mL podstawowego DMEM.
   2. Podłączyć kolumnę heparin sepharose 5 mL do przewodów i przepuścić 25 mL podstawowego DMEM w celu usunięcia konserwantu.
4. Przepuścić 0,2 µM przefiltrowanego surowego lizatu przez kolumnę z prędkością przepływu 1-2 kropli/s.

UWAGA: Należy dopilnować, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza i nie dopuścić do wyschnięcia kolumny, ponieważ naruszy to jej strukturę i uniemożliwi elucję AAV. W przypadku wyschnięcia kolumny należy ją utylizować i użyć nowej kolumny do pozostałej części lizatu surowego.

5. Nałóż cały surowy lizat na kolumnę z heparyną i użyj następujących roztworów do płukania kolumny.
   1. Przepłucz, używając 50 mL 1× zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) bez Mg²⁺ i Ca²⁺.
   2. Przepłucz, używając 15 mL 0,5% N-lauroylosarkozyny w HBSS bez Mg²⁺ i Ca²⁺.
   3. Przepłucz, używając 50 mL HBSS bez Mg²⁺ i Ca²⁺.
   4. Przepłucz, używając 50 mL HBSS z Mg²⁺ i Ca²⁺
   5. Przepłucz, używając 50 mL 200 mM NaCl/HBSS z Mg²⁺ i Ca²⁺.
   6. Eluuj 5 × 5 mL (łącznie 25 mL) za pomocą 300 mM NaCl/HBSS z Mg²⁺ i Ca²⁺ i oznacz eluaty jako E1-E5 (każda frakcja ma objętość 5 mL).
6. Koncentrowanie wirusa za pomocą koncentratora odśrodkowego
   1. Wirować koncentrator odśrodkowy zawierający bufor do wstępnego przygotowania przy 900 × g przez 2 min. Odrzucić przefiltrowany ciecz.
   2. Przepłukać filtr koncentratora odśrodkowego 4 mL HBSS z Mg²⁺ i Ca²⁺ i wirować przy 1000 × g przez 2 min; odrzucić przefiltrowaną ciecz.
   3. Dodać eluat E2 do koncentratora odśrodkowego. Wirować przy 1000 × g przez 5 min i odrzucić przefiltrowaną ciecz.
   4. Dodać pozostałą część E2, a następnie dodać E3 do koncentratora odśrodkowego i wirować przy 1000 × g przez 5 min, aż objętość skoncentrowanego wirusa wyniesie około 1 mL.
      UWAGA: Należy unikać wirowania wektora do poziomu poniżej filtra. Nie należy koncentrować frakcji E1, E4 ani E5 w koncentratorze odśrodkowym, ponieważ zawierają one bardzo mało lub wcale wektora oraz zawierają zanieczyszczenia.
   5. Przenieść skoncentrowany wirus z koncentratora odśrodkowego za pomocą końcówki z filtrem p200 do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 mL.
   6. Przepłukać koncentrator odśrodkowy 200 µL HBSS z Mg²⁺ i Ca²⁺, aby usunąć z filtra pozostałe cząstki AAV. Energicznie pipetować w górę i w dół kilkakrotnie (przez ok. 30 s), aby odczepić wirusy przylegające do membrany, a następnie przenieść ciecz do probówki 1,5 mL z pozostałą częścią wirusa. Dobrze wymieszać zawartość probówki.
   7. Odmierzyć alikwot 5 µL do ekstrakcji DNA i przechowywać oczyszczony wektor w temperaturze -80 °C.
7. Przepłukać kolumnę, używając 25 mL 2 M NaCl. Następnie użyć 25 mL 0,1% Triton X-100, wstępnie podgrzanego do 37 °C, aby przepłukać kolumnę. Następnie przepłukać kolumnę, używając 50 mL sterylnej dH₂O, a potem 25 mL 20% etanolu.
8. Upewnić się, że membrana kolumny jest całkowicie nasycona 20% etanolem, ponieważ jest on roztworem do przechowywania. Zamknąć kolumnę dostarczonymi zatyczkami i przechowywać w temperaturze 4 °C.
9. Przechowywać dreny w 1 M NaOH.
   UWAGA: Jeśli są prawidłowo czyszczone, kolumny z sefarozą z heparyną mogą być używane wielokrotnie, do pięciu razy.

Wyniki

Rycina 1: Obsługa stosu komórkowego podczas wysiewu komórek i transfekcji. Aby wysiać komórki w stosie komórkowym, należy rozpocząć od zdjęcia jednej z nasadek wentylacyjnych i wlania 1 L uprzednio ogrzanej, pełnej pożywki Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) z wymaganą ilością komórek HEK293 (A). Należy równomiernie rozprowadzić komórki i pożywkę, zakręcając obie nasadki wentylacyjne, a następnie zgromadzić całą pożywkę w narożniku stosu komórkowego za pomocą jednej z nasadek i ustawić go w tym narożniku (B), położyć stos komórkowy na boku (C), a następnie obrócić go o 90° (D) tak, aby otwory wentylacyjne znajdowały się u góry (E). Należy ostrożnie opuścić stos komórkowy do normalnej pozycji poziomej i upewnić się, że wszystkie komory stosu są całkowicie pokryte pożywką (F). Podczas transfekcji należy odkręcić obie nasadki wentylacyjne i powoli wylać starą pożywkę do sterylnego pojemnika na odpady, dbając o równomierny przepływ, aby nie naruszyć monowarstwy komórek (G).

Rysunek 2: Konfiguracja pompy perystaltycznej do oczyszczania wirusów towarzyszących adenowirusom (AAV). Poprowadź dren z lizatu surowego przez pompę perystaltyczną do kolumny z macierzą heparynową.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Filtr 0.22 μm	Millipore Sigma	S2GPU05RE
Trypsyna 0.25%	Fisher Scientific	SM2001C
10-komorowy system CellStack	Corning	3271
Butelka PETG 1L	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
Szalki do hodowli komórkowej	Greiner bio-one	7000232	płytki 15 cm
Stożkowa probówka do hodowli	Thermo Fisher Scientific	339650	probówka stożkowa 15 mL
Stożkowa probówka do hodowli	Fisher Scientific	14955240	probówka stożkowa 50 mL
Podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) z 1000 mg/L D-glukozą i L-glutaminą	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Etanol	Greenfield	P016EA95	Rozcieńczyć alkohol etylowy (95% obj.) do 20% dla sekcji 3.7.4
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) z Mg²⁺ i Ca²⁺	Thermo Fisher Scientific	SH302268.02
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) bez Mg²⁺ i Ca²⁺	Thermo Fisher Scientific	SH30588.02
Komórki HEK293	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	Po otrzymaniu rozmrozić komórki i hodować zgodnie z protokołem producenta. Gdy komórki zostaną poddane minimalnej liczbie pasażów i będą dobrze rosły, zamrozić subfrakcję w aliquotach na przyszłe potrzeby i przechowywać w ciekłym azocie. Należy zawsze używać komórek o numerze pasażu poniżej 30. Jeśli hodowane komórki zostały spasażowane więcej niż 30 razy, zaleca się rozpoczęcie nowej hodowli z przechowywanych aliquotów
Kolumna z siarczanem heparyny	Cytiva Life Sciences	17040703
Podkładka wspierająca do probówek wirówkowych o dużej pojemności	Corning	CLS431124	Podkładkę wspierającą należy stosować z probówkami wirówkowymi o dużej pojemności, chyba że rotor wirówki posiada odpowiednie podkładki z dnem w kształcie litery V
Probówki wirówkowe o dużej pojemności	Corning	CLS431123-6EA	probówki wirówkowe 500 mL
Probówka do mikrocentryfugi	Fisher Scientific	05-408-129	probówka do mikrocentryfugi 1.5 mL, wysterylizować przed użyciem
Woda stopnia molekularnego	Cytiva Life Sciences	SH30538.03
Sól sodowa N-lauroylosarkozyny	Sigma Aldrich	L5125	UWAGA. Stosować rękawiczki
NaCl	Thermo Fisher Scientific	BP35810
Optimem, podłoże z obniżoną zawartością surowicy	Thermo Fisher Scientific	31985070
Pipety Pasteura	Fisher Scientific	13-678-20D	Wysterylizować przed użyciem
Bufor fosforanowy (10x)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Rozcieńczyć do 1x do zastosowania na komórkach
Roztwór penicyliny i streptomycyny	Cytiva Life Sciences	SV30010
Plazmid pHelper	Projekt własny (de novo) lub z repozytorium plazmidów	NA
Kuweta do pipet	Thermo Fisher Scientific	13-681-502	Nabyć sterylne kuwety do pipet
Polyethylen glycol tert-octylphenyl ether (Triton X-100)	Thermo Fisher Scientific	9002-93-1	UWAGA. Stosować rękawiczki
Polyethylenimine (PEI)	Polyscience	24765-1	Postępować zgodnie z instrukcjami producenta w celu przygotowania 1L roztworu. Przefiltrować przez filtr 0.22μm i przechowywać w 4°C
Plazmid pTrangene	Projekt własny (de novo) lub z repozytorium plazmidów	NA	Musi zawierać SV40 polyA w genomie, aby być kompatybilnym z miareczkowaniem AAV w sekcji 5.0
Przewody pompowe	Cole-Parmer	RK-96440-14	Zoptymalizować długość przewodów i zawartość wirusa w frakcjach E1-E5
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Thermo Fisher Scientific	SS266-4
Błękit trypanu	Bio-Rad	1450021