Transdukcja zapłodnionych zarodków szczura z wykorzystaniem wektora lentiwirusowego

Streszczenie

Źródło: Koza, P., et al. Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach. J. Vis. Exp. (2020)

Niniejszy film demonstruje dostarczanie wektorów lentiwirusowych do zapłodnionych embrionów szczura za pomocą mikroiniekcji w celu uzyskania stabilnej integracji transgenu do generowania szczurów transgenicznych.

Protokół

Wszystkie procedury z wykorzystaniem próbek zwierzęcych zostały przeanalizowane i zatwierdzone przez odpowiednią komisję etyki ds. doświadczeń na zwierzętach.

1. Mikroiniekcja wektorów lentiwirusowych do zarodka w stadium jednego komórki pod błonę przejrzystą
   UWAGA: Do mikroiniekcji należy używać zarodków w stadium jednego komórki z dwoma widocznymi jąderkami przednimi (Rycina 1).
   1. Rozmrozić alikwot lentiwirusa (LV) w temperaturze pokojowej, a następnie wirować przy 10,000 x g w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 min, aby osadzić pozostałe zanieczyszczenia komórkowe.
   2. Przygotowanie do mikroiniekcji
      1. Przygotować szklane pipety przytrzymujące (kapilary z borokrzemianu) za pomocą mikrokuźni. Wyciągnąć kapilarę szklaną nad płomieniem, aby uzyskać końcówkę o długości 5–10 cm. Odłamać pipetę, pozostawiając końcówkę o długości ~4 cm. Średnica zewnętrzna powinna wynosić ~80–120 µm.
         UWAGA: Należy upewnić się, że końcówka pipety jest idealnie prosta i gładka.
      2. Zamontować wyciągniętą pipetę w mikrokuźni z końcówką przed włóknem grzejnym. Rozgrzać włókno bardzo blisko końcówki pipety i pozwolić jej skurczyć się do średnicy ~15 µm (około 20% wielkości zarodka). Ustawić pipetę prostopadle do włókna grzejnego, 2–3 mm od końcówki pipety i rozpocząć grzanie. Szkło zmięknie. Grzać, aż uzyska kąt 15°.
      3. Przygotować borokrzemianowe kapilary szklane do mikroiniekcji z włóknem za pomocą wyciągarki do pipet. Włożyć kapilarę do komory wyciągania. Przeprowadzić test rampy (przy pierwszym użyciu nowego szkła oraz za każdym razem po wymianie włókna). Ustawić parametr Heat na wartość rampy -10, Pull na 100, Velocity na 150 i Time na 100.
         UWAGA: Zmodyfikować parametry, aby uzyskać optymalną kapilarę do iniekcji.
      4. W dygestorium z laminarnym przepływem powietrza załadować około 2 µL roztworu wirusowego do pipety do mikroiniekcji za pomocą końcówki mikroładownika.
      5. Przygotować szalkę do mikroiniekcji (pokrywkę szalki Petriego 60 mm) z kroplą 100 µL pożywki M2 (na środku), przykrytą parafiną ciekłą lub olejem mineralnym.
      6. Zamocować pipetę przytrzymującą oraz kapilarę do mikroiniekcji załadowaną roztworem wirusowym do mikromanipulatora i szalki do mikroiniekcji pod mikroskopem odwróconym.
   3. Wykonanie mikroiniekcji
      1. Przenieść 15–20 zarodków w stadium jednego komórki do kropli M2 na szalce do mikroiniekcji. Przytrzymać zarodek za pomocą pipety przytrzymującej.
      2. Przy powiększeniu 400x wstrzyknąć roztwór LV pod błonę przejrzystą do przestrzeni okołopęcherzykowej za pomocą kapilary szklanej podłączonej do automatycznego injektora. Przytrzymać kapilarę pod błoną przejrzystą przez chwilę.
         UWAGA: Przy zastosowaniu delikatnego nadciśnienia roztwór wirusowy będzie wypływać z kapilary iniekcyjnej w sposób ciągły, jednak objętość podawanej zawiesiny nie może być kontrolowana.
      3. Za pomocą precyzyjnej pipety przenieść zarodki z powrotem do naczynia hodowlanego w inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂ . Liczba iniekcji jednego zygoty może być różna i może zostać dostosowana w zależności od stężenia wektora wirusowego.
         UWAGA: Wstrzyknięte zarodki mogą zostać przeniesione do matek zastępczych w stadium jednego komórki lub inkubowane przez noc (O/N) w pożywce M16 przed przeniesieniem w stadium dwóch komórek. Należy unikać przedłużonej hodowli in vitro zarodków szczura.

Wyniki

Rycina 1. Fotografia mikroskopowa embrionu szczura w stadium jednokomórkowym przygotowanego do podstrefowej iniekcji wektora lentiwirusowego. Embrion został unieruchomiony za pomocą pipety trzymającej. Widoczne są dwa jąderka zawierające materiał genetyczny matki i ojca oraz ciałko polarne. Pasek skali = 20 μm.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zespoły rurek aspiratora do kalibrowanych pipet mikrokapilarnych	Sigma	A5177-5EA
Kapilary z borokrzemianowego szkła z włóknem GC100TF-15	Harvard Apparatus Limited	30-0039	Kapilara do iniekcji
Płytka do hodowli tkankowej CELLSTAR 35 mm	Greiner Bio-One	627160
Płytka do hodowli tkankowej CELLSTAR 60 mm	Greiner Bio-One	628160
Olej mineralny	Sigma	M8410-500ML
Mikroskop odwrócony	Zeiss	Axiovert 200
Pożywka M2	Sigma	M7167
VacuTip	Eppendorf	5175108	Kapilara trzymająca
Pożywka M16 EmbryoMax	Sigma	MR-016-D