Chromatografia powinowactwa do niklu Rozmrozić jeden osad bakteryjny na lodzie. UWAGA: Proces ten zajmie znaczny czas (około 2–3 h). Gdy osad rozmrozi się do postaci zawiesiny komórkowej, dodać dodatkowe 50 μM fluorku fenylometanosulfonylu (PMSF) (roztwór stokowy 10 mM). Przechowywać 50-ml probówkę z zawiesiną bakterii na lodzie. Bakterie sonikować przy amplitudzie 30% przez 30 s (1 s włączone, 1 s wyłączone) na każdy osad otrzymany z 1 L hodowli, używając sonikatora z bio-tubą o średnicy 0,5 cala i zwężoną mikrokońcówką o średnicy 0,125 cala, przy częstotliwości 20 kHz i maksymalnej mocy 40 W. Przenieść próbkę komórek do zimnej probówki do ultrawirówki. Należy użyć poliwęglanowych zestawów probówek (średnica 25 mm, wysokość 89 mm) kompatybilnych z rotorem o stałym kącie typu 60 Ti. Można stosować inne probówki i rotory, jeśli osiągnięta zostanie ta sama siła odśrodkowa. Wirować przy 120 0 x g przez 60 min w temperaturze 4 °C. Powinien powstać wyraźny osad. Nadosad może mieć żółty kolor. Przenieść nadosad poprzez przelanie lub pipetowanie do zimnej, stożkowej probówki 50 ml. Odnotować objętość; powinna być ona zbliżona do objętości buforu do resuspensji użytego przed gwałtownym zamrażaniem. Jeśli nadosad jest lepki, może być zanieczyszczony bakteryjnym DNA, co mogłoby zapchać kolumnę chromatograficzną. W takim przypadku powtórzyć ultrawirowanie w celu osadzenia bakteryjnego DNA. Przygotować 50 ml buforu A (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 50 μM PMSF) oraz 50 ml buforu B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 μM PMSF, 20 mM imidazolu). UWAGA: W tym protokole system szybkiej chromatografii cieczowej (FPLC), wszystkie bufory oraz próbka powinny być utrzymywane w temperaturze 4 °C w pomieszczeniu chłodniczym. Bufory A i B przefiltrować sterylnie za pomocą jednorazowych jednostek filtrujących 0,2 μm. W zależności od systemu FPLC przemyć pompę A i pompę B odpowiednio buforem A i buforem B. Przepuścić przez system mieszaninę 90% buforu A i 10% buforu B, aż odczyty przewodnictwa i absorbancji w ultrafiolecie (UV) ustabilizują się. Maksymalna szybkość przepływu zależy od instrumentu; zastosować szybkość przepływu 5 ml/min przy maksymalnym limicie ciśnienia 1,0 MPa. Przygotować kolumnę FPLC o długości 10 mm i średnicy 5 mm z 1,5 ml żywicy obciążonej niklem (maksymalna pojemność wiążąca 50 mg/ml, maksymalne ciśnienie 1 MPa). Kolumna może zostać przygotowana dzień przed oczyszczaniem i przechowywana w temperaturze 4 °C. Podłączyć kolumnę do urządzenia FPLC. Ekwilibrować kolumnę za pomocą 20 ml mieszaniny 90% buforu A i 10% buforu B (20 mM imidazolu) przy szybkości przepływu 0,5 ml/min i maksymalnym limicie ciśnienia 0,5 MPa. Urządzenie powinno rejestrować w czasie rzeczywistym dane o przewodnictwie i absorbancji UV przy 280 nm (A280). Odczyty przewodnictwa i UV powinny się ustabilizować. Jeśli odczyty nie są stabilne, kontynuować przepływ buforów przez kolumnę aż do ich stabilizacji. Nałożyć próbkę białka (~10 ml na osad) na kolumnę przy szybkości przepływu 0,15 ml/min i maksymalnym limicie ciśnienia 0,5 MPa. Szybkość przepływu i ciśnienie w kolumnie pozostają bez zmian przez cały proces oczyszczania. Przelew zebrać do probówki 50 ml. Przemyć kolumnę 20 ml mieszaniny 90% buforu A i 10% buforu B. Przesącz z płukania zebrać do probówki 50 ml. Eluować białka za pomocą 20 ml gradientu liniowego od 10% do 10% buforu B (od 20 mM do 20 mM imidazolu). Na koniec przemyć kolumnę 5 ml 10% buforu B (20 mM imidazolu). Gradient oraz końcowe płukanie zebrać w frakcjach po 0,27 ml. Połączyć 15 μL 2-krotnego buforu do próbek SDS-PAGE z 15 μL przelewu, płukania oraz frakcji z piku A280. Gotować próbki przez 3 min. Przygotować dwa żele SDS-PAGE 10%. Na żele nałożyć 10 μL każdej próbki oraz 4 μL wstępnie zabarwionych standardów białkowych. Przeprowadzić elektroforezę, zabarwić i przeanalizować żele. Połączyć frakcje, które na podstawie oceny wizualnej wydają się zawierać niemal czystą integrazę prototypowego wirusa pienistego (PFV IN). Zmierzyć objętość za pomocą pipety, zazwyczaj wynosi ona od 8 do 10 ml. Za pomocą spektrofotometru zmierzyć A280 połączonych frakcji i obliczyć całkowitą ilość białka PFV IN; typowa wydajność wynosi ~10 mg na litr hodowli indukowanej. Współczynnik ekstynkcji PFV IN z tagiem heksahistydynowym wynosi 59 360 cm⁻¹ M⁻¹. Lopez Jr., M. A., itp.Wykrywanie i usuwanie zanieczyszczeń nukleazami podczas oczyszczania rekombinowanej integrazji prototypowego wirusa piankowatego. J. Vis. Exp. (2017)
W tym filmie zaprezentowano oczyszczanie viralnej integrazji z tagiem polihistydynowym za pomocą chromatografii powinowactwa do niklu. Protokół wykorzystuje elucję gradientem imidazolu w celu selektywnego wyizolowania integrazji na podstawie jej powinowactwa do żywicy naładowanej niklem.
