Oczyszczanie integraz wirusowej przy użyciu chromatografii powinowactwa do heparyny

Streszczenie

Źródło: Lopez Jr., M. et al. Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase. J. Vis. Exp. (2017)

W niniejszym filmie zaprezentowano procedurę oczyszczania integraz wirusowej z zanieczyszczeń nukleazami bakteryjnymi przy użyciu chromatografii kolumnowej na żywicy heparin Sepharose, a następnie analizę SDS-PAGE w celu potwierdzenia czystości białka.

Protokół

1. Chromatografia powinowactwa do heparyny
   1. Przygotować 250 mL Buforu C (50 mM chlorku tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris-HCl), pH 7,5, 10 mM ditiotreitolu (DTT), 0,1 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), 500 μM fluorku fenylometylosulfonylowego (PMSF)) oraz 250 mL Buforu D (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl).
      UWAGA: W tym protokole system szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC), bufory oraz próbka są przechowywane w pomieszczeniu chłodniczym w temperaturze 4 ˚C.
      1. Przefiltrować sterylnie Bufory C i D za pomocą jednorazowych jednostek filtrujących o rozmiarze 0,2 μm. W zależności od systemu FPLC, wypłukać pompę A i pompę B odpowiednio Buforem C i Buforem D. Przepuścić przez system 80% Buforu C i 20% Buforu D, aż odczyty przewodności i absorbancji w ultrafiolecie (UV) ustabilizują się. Maksymalna prędkość przepływu zależy od urządzenia; rutynowo stosujemy prędkość przepływu 5 mL/min przy maksymalnym limicie ciśnienia 1,0 MPa.
   2. Przygotować kolumnę FPLC o długości 80 mm i średnicy 5 mm z 1 mL żywicy heparin Sepharose (maksymalna pojemność wiązania 2,0 mg wołowej antytrypsyny III na 1 mL żywicy; maksymalne ciśnienie 1,4 MPa). Kolumnę można przygotować dzień przed oczyszczaniem i przechowywać w temperaturze 4 °C. Podłączyć kolumnę do urządzenia FPLC.
      1. Równoważyć kolumnę za pomocą 20 mL mieszaniny 80% Buforu C i 20% Buforu D (200 mM NaCl) przy prędkości przepływu 0,5 mL/min i maksymalnym limicie ciśnienia 1 MPa. Urządzenie powinno zbierać dane w czasie rzeczywistym dotyczące przewodności i absorbancji UV przy 280 nm (A₂₈₀). Odczyty przewodności i UV powinny się ustabilizować. Jeśli odczyty nie są stabilne, kontynuować przepuszczanie buforów przez kolumnę do momentu ich stabilizacji.
   3. Zredukować stężenie NaCl w próbce integrazą prototypowego wirusa piankowego (PFV IN) do 200 mM poprzez dodanie 1,5 objętości Buforu C. Na przykład dodać 15 mL Buforu C do 10 mL PFV IN. Nasza całkowita objętość wynosi zazwyczaj ~25 mL.
   4. Nałożyć rozcieńczoną próbkę PFV IN na kolumnę heparin Sepharose przy prędkości przepływu 0,5 mL/min i maksymalnym limicie ciśnienia 1,0 MPa. Prędkość przepływu i ciśnienie kolumny pozostają niezmienione przez cały proces oczyszczania. Zebrać frakcję niezatrzymaną (flow-through) do probówki stożkowej 50 mL.
      1. Wypłukać kolumnę za pomocą 20 mL mieszaniny 80% Buforu C i 20% Buforu D (200 mM NaCl), zbierając wypłukiny do probówki stożkowej 50 mL. Eluować kolumnę za pomocą 30 mL gradientu liniowego od 20% do 100% Buforu D (od 200 mM do 1 M NaCl).
      2. Wypłukać kolumnę za pomocą 5 mL 100% Buforu D. Zebrać gradient i końcowy wypłuk w frakcjach o objętości 0,37 mL.
   5. Próbkę nałożoną, frakcję niezatrzymaną, wypłukiny oraz frakcje elucji analizować za pomocą 8% elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z dodecylsiarczanem sodu (SDS-PAGE). PFV IN, po odcięciu znacznika heksahistydynowego, ma masę cząsteczkową 44 394 Da, a współczynnik ekstynkcji bez znacznika heksahistydynowego wynosi 59 360 cm^-1 M^-1. Wszystkie frakcje przechowywać w temperaturze 4 ˚C do czasu zakończenia testu nukleazowego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
IPTG (izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozyd)	Denville Scientific	CI8280
Tris Ultra Pure	Gojira Fine Chemicals	UTS1003
NaCl	P212121	RP-S23020
PMSF (fenylometanosulfonylofluorek)	Amresco	754
DTT (ditiotreitol)	P212121	SV-DTT
UltraPure EDTA	Invitrogen/Gibco	15575
Heparin Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0998-01