W niniejszym filmie opisano test plackowy wirusa z wykorzystaniem cząsteczek pseudowirusa koronawirusa. Rozcieńczony pseudowirus jest dodawany do monowarstwy komórek ssaków, a następnie inkubowany z nakładką z metylocelulozy. Placki utworzone przez zainfekowane komórki są liczone wizualnie w celu oznaczenia miana wirusa zakaźnego.
Artykuł metodologiczny
Ilościowe oznaczenie cząsteczek pseudowirusa metodą plackową
22 wyświetleń
⸱
30 września 2026
W tym artykule
Streszczenie
Protokół
Miareczkowanie pseudowirusa na podstawie wirusa zapalenia jamy ustnej bydła (vesicular stomatitis virus) wykazującego białko kolca koronawirusa oraz ulepszone zielone białko fluorescencyjne (VSV-S-eGFP)
1. Rozcieńczenia seryjne w celu oznaczenia miana wirusa
1. Wysiać komórki Vero E6 na płytkach 6-dołkowych w gęstości 6 × 105 komórek na dołek w podłożu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) z dodatkiem 10% FBS (płytkowej surowicy bydlęcej) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂.
UWAGA: Można również stosować komórki Vero z nadekspresją TMPRSS2 i hACE2.
2. Przygotować 10-krotny szereg rozcieńczeń wirusa VSV-SeGFP w zimnym, bezzsrytkowym DMEM, dozując po 900 μL medium do siedmiu probówek do mikrowirówki. Oznakować probówki od 1 do 7. Do pierwszej probówki dodać 100 μL zawiesiny wirusa i krótko wymieszać na wirówce vorex. Przenieść 100 μL rozcieńczonego wirusa z probówki 1 do probówki 2 i krótko wymieszać na vorexie; powtarzać czynność aż do probówki 7.
3. Odessać pożywkę ze wszystkich dołków płytki 6-dołkowej zawierającej komórki Vero E6 i zastąpić ją 500 μL rozcieńczeń od 105 do 107. Inkubować płytki przez 45 min w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂, delikatnie kołysząc płytką co 15 min.
4. Odessać inokulum i zastąpić je warstwą pokrywową zawierającą mieszaninę 2x DMEM i 6% karboksymetylocelulozy (CMC) w stosunku 1:1 (końcowe stężenie 3% CMC), uzupełnioną o 10% FBS; inkubować w 34 °C z 5% CO₂ przez 48 h.
UWAGA: Podczas etapu infekcji należy wstępnie podgrzać mieszaninę do pokrycia w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 min. Zamiast CMC można zastosować mieszaninę w stosunku 1:1 1% agarozy z 2x DMEM uzupełnionym o 10% FBS. Aby wykonać pokrycie agarozą, należy zagotować 1% agarozy (w dH₂O) i wymieszać z zimnym 2x DMEM. Przed dodaniem do monowarstwy komórek należy upewnić się, że mieszanina ma odpowiednią temperaturę (około 37-40 °C). W przypadku zastosowania agarozy do pokrycia, komórki muszą zostać utrwalone poprzez inkubację w 2 mL mieszaniny metanolu z kwasem octowym w stosunku 3:1 przez co najmniej jedną godzinę przed barwieniem.
2. Barwienie i obliczanie miana wirusa
1. Wizualizuj pęczki wirusa (plaki) poprzez barwienie fioletem krystalicznym lub bezpośrednią wizualizację eGFP pod mikroskopem fluorescencyjnym.
2. Aby zabarwić płytki, odessać warstwę overlay, raz przemyć PBS, a następnie dodać 2 mL 0,1% fioletowego krystalicznego (w 80% metanolu i dH₂O) do każdej studni. Umieścić na kołysarce do płytek przez około 20 min w temperaturze pokojowej przed odbarwieniem. Usunąć fiolet krystaliczny i delikatnie dwukrotnie przemyć każdą studnię, używając dH₂O lub PBS.
UWAGA: Etapy płukania i barwienia należy przeprowadzać ostrożnie, pipetując powoli w stronę ścianek każdej studzienki, aby zapewnić nienaruszenie monowarstwy komórek podczas całej procedury.
3. Pozostaw płytki do wyschnięcia przez co najmniej 1 h przed policzeniem placków. Upewnij się, że licznik placków obejmuje studzienki zawierające od 20 do 200 placków. Aby obliczyć miano wirusa w jednostkach tworzących placki (PFU) na mL, pomnóż czynnik rozcieńczenia liczonej studzienki przez objętość inokulum, a następnie podziel liczbę placków obecnych w danej studience przez tę wartość.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,25% trypsyna-EDTA (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| komórki Vero E6 | ATCC | CRL-1586 | |
| karboksymetyloceluloza | Sigma | C5678 | |
| pożywka DMEM (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| pożywka DMEM (proszek) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| bufor fosforanowy DPBS | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| penicylina/streptomycyna | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| przeciwciało neutralizujące białko Spike SARS-CoV-2 (2019-nCoV), mysie Mab | SinoBiological | 40592-MM57 |
