Neutralizacja pseudowirusów wykazujących ekspresję białka kolca koronawirusa za pomocą surowicy pacjentów w procesie zapśredniczonym przez przeciwciała

Streszczenie

Źródło: Jamieson, T. R., et al. Detection of SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies using High-Throughput Fluorescent Imaging of Pseudovirus Infection. J. Vis. Exp. (2021)

W niniejszym filmie zaprezentowano neutralizację pseudowirusów niosących białka kolca koronawirusa za pośrednictwem przeciwciał z wykorzystaniem surowicy pacjentów, badaną poprzez wysokoprzepustowe obrazowanie fluorescencyjne monowarstw zainfekowanych komórek nabłonkowych.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi IRB instytutu.

1. Rozcieńczanie przeciwciał lub surowicy oraz infekcje

UWAGA: Niniejszy protokół można zastosować do pomiaru neutralizacji pseudowirusa VSV-S-eGFP (wirusa zapalenia pęcherzykowego jamy ustnej wykazującego białko kolca koronawirusa oraz wzmocnione zielone białko fluorescencyjne) zarówno za pomocą komercyjnie dostępnych przeciwciał, jak i surowicy pacjentów, a także surowicy pobranej od zwierząt w ramach przedklinicznych badań nad rozwojem szczepionek.

1. Seria rozcieńczeń seryjnych
   1. Przed rozcieńczeniem próbek surowicy należy poddać każdą próbkę inaktywacji termicznej w kąpieli wodnej o temperaturze 56 °C przez 30 min w celu inaktywacji dopełniacza. Należy przestrzegać niezbędnych środków ostrożności podczas pracy z próbkami pacjentów; pojemniki z próbkami należy otwierać wyłącznie w komorze do hodowli tkanek oraz używać odpowiednich środków ochrony osobistej dla poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.
   2. Przygotować serię rozcieńczeń w pustej płytce 96-dołkowej (Płytka 1).
   3. Wszystkie rozcieńczenia rozpocząć w rzędzie A płytki 96-dołkowej w objętości 80 µL. *W przypadku próbek pacjentów serię rozcieńczeń rozpocząć od 1:10, dodając 8 µL surowicy do 72 µL bezzsrotkowego zmodyfikowanego pożywki Eagle'a Dulbecco (DMEM) (z 1% penicyliną/streptomycyną).
      UWAGA: Stężenie użytego przeciwciała neutralizującego będzie zależeć od aktywności określonej przez producenta. W przypadku przeciwciała neutralizującego białko Spike SARS-CoV-2 użytego w tej procedurze (patrz Tabela materiałów), należy rozpocząć od 5 µg/mL, aby zaobserwować co najmniej 50% neutralizacji.
   4. Do rzędów od B do G dodać 40 µL bezzsrotkowego DMEM (z 1% penicyliną/streptomycyną), a do rzędu H dodać 80 µL. Do rzędu H nie dodawać wirusa, ponieważ służy on jako kontrola zawierająca wyłącznie komórki.
   5. Używając wielokanałowej pipety 12-dołkowej, wymieszać i przenieść 40 µL rozcieńczonej surowicy lub przeciwciał z rzędu A do rzędu B. Mieszać i powtarzać czynność aż do rzędu F, a następnie odrzucić 40 µL z rzędu F. Do rzędu G nie dodawać surowicy, ponieważ stanowi on rząd kontrolny zawierający wyłącznie wirusa.
2. Zakażenie i nałożenie warstwy ochronnej
   1. Przygotować odpowiednią objętość rozcieńczonego VSV-S-eGFP, aby zakazić każdy dołek z wielokrotnością zakażenia (MOI) 0,05 (lub 2000 jednostek tworzących plaki (pfu)). (Przy obliczeniach należy pamiętać, że na komórki zostanie przeniesione tylko 60 µL z całkowitej objętości 80 µL; dlatego należy pomnożyć objętość wirusa przez 1,33, aby zachować 2000 pfu).
      UWAGA: Ponieważ VSV-S-eGFP jest wrażliwy na temperaturę, należy przechowywać zapasy wirusa w lodzie, gdy nie są używane, i unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ miana będą się różnić po wielokrotnym mrożeniu.
   2. Do każdego dołka w rzędach od A do G Płytki 1 dodać 40 µL rozcieńczonego wirusa i wymieszać, pipetując w górę i w dół 4–5 razy. Inkubować płytkę przez 1 h w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂.
   3. Wyjąć z inkubatora płytkę z komórkami (Płytka 2) i ostrożnie odessać pożywkę ze wszystkich dołków. Przenieść 60 µL mieszaniny przeciwciał i wirusa z Płytki 1 na Płytkę 2 i inkubować przez 1 h w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂, kołysząc płytką co 20 min.
   4. Uzupełnić każdy dołek 140 µL warstwy ochronnej zawierającej karboksymetylocelulozę (CMC) w DMEM, tak aby końcowe stężenie CMC wynosiło 3% (z 10% FBS (pł Tk. cielęcej) i 1% penicyliną/streptomycyną). Umieścić Płytkę 2 w inkubatorze ustawionym na 34 °C przy 5% CO₂ na około 24 h przed obrazowaniem.
      UWAGA: Przed etapem zakażenia należy podgrzać mieszaninę warstwy ochronnej w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 15 min.

2. Obrazowanie i kwantyfikacja (dzień 3)

1. Obrazuj płytki za pomocą automatycznego analizatora fluorescencyjnego (stosując filtr izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) lub alternatywny filtr z długością fali pobudzenia 488 nm). Ilościowo określ stopień infekcji wirusowej poprzez stworzenie protokołu, który automatycznie identyfikuje i liczy poszczególne ogniska eGFP (enhanced green fluorescent protein). Jeśli funkcja automatycznego liczenia nie jest dostępna, użyj oprogramowania ImageJ w celu określenia liczby ognisk eGFP.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Karboksymetyloceluloza	Sigma	C5678
Podłoże Eagle'a modyfikowane przez Dulbecco (Gibco)	Fisher scientific	10-013-CV
Podłoże Eagle'a modyfikowane przez Dulbecco (proszek) (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	12-800-017
Komórki Vero E6	ATCC	CRL-1586
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym Dulbecco (DPBS)	Fisher scientific	21-031-CV