Monitorowanie etapowej ekspresji genów wirusa vaccinia z użyciem reporterów fluorescencyjnych

Streszczenie

Źródło: Rozelle, D. K., et al. Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression. J. Vis. Exp. (2014)

Niniejszy materiał wideo demonstruje metodę monitorowania replikacji wirusa vaccinia z wykorzystaniem reporterów fluorescencyjnych regulowanych przez promotory specyficzne dla danej fazy. Sekwencyjna ekspresja zielonych, czerwonych i niebieskich białek fluorescencyjnych znakuje wczesną, pośrednią i późną fazę infekcji, co umożliwia wysokoprzepustową analizę ekspresji genów wirusowych specyficznych dla konkretnego etapu.

Protokół

1. Wysiewanie komórek

1. Odseparuj komórki HeLa od płytki i rozcieńcz w pożywce wzrostowej (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM], 2 mM L-glut, 10% płodowej surowicy bydlęcej [FBS]) do stężenia około 2.0 x 10⁵ komórek/ml. Rozlej 100 μl/dołek na czarną 96-dołkową płytkę z przezroczystym, płaskim dnem (20 000 komórek/dołek).
2. Inkubuj komórki przez 24 hr do uzyskania konfluencji w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂.

2. Infekowanie komórek

1. Rozcieńczenie wirusów i zakażenie komórek.
   1. Rozmrozić fluorescencyjne wirusy TrpV (Triple virus; Early Venus, Intermediate mCherry, Late TagBFP) oraz PLV (Promoter-less Venus) i rozbić agregaty za pomocą sonikacji przez 5 minut. Alternatywnie surowe zapasy wirusa można zmieszać w stosunku 1:1 z 0,25 mg/ml trypsyny w pożywce do zakażania i inkubować w 37 °C przez 30 min.
   2. Rozcieńczyć surowe zapasy wirusa w podgrzanej do 37 °C pożywce do zakażania (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS). W przypadku zakażeń z wysokim MOI (10 PFU/cell), rozcieńczyć zapas wirusa do stężenia 1,0 x 10⁷ PFU/ml, przyjmując 5 x 10⁴ komórek/dołek i objętość inokulum 50 μl. Należy zaplanować zakażenie 3 powtórnych dołków dla każdego wariantu z TrpV oraz kolejnych 3 powtórnych dołków dla tego samego wariantu z PLV, aby uwzględnić fluorescencję tła specyficzną dla każdego zabiegu.
   3. Zakażać dołki, dodając 50 μl/dołek rozcieńczonego wirusa w pożywce do zakażania. Moment ten definiuje się jako czas = 0 h po zakażeniu (0 hpi).
2. Inkubować przez 6-24 h w inkubatorze w temperaturze 37 °C + 5% CO₂.

3. Fixacja komórek

1. Utrwal komórki, dodając 100 μl 8% paraformaldehydu do medium infekcyjnego znajdującego się w każdej studzience. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 min, chroniąc przed światłem.
   UWAGA: Zaleca się dodawanie 2x paraformaldehydu (8%) bezpośrednio do medium infekcyjnego, aby zapobiec aerozolizacji zakaźnej vaccinii, do której może dojść w przypadku bezpośredniego wylania medium o wysokim mianie do pojemnika na odpady przed utrwaleniem.
2. Usuń utrwalacz, odwracając płytkę nad pojemnikiem na odpady.
3. Dodaj 100 μl soli fizjologicznej w temperaturze pokojowej (PBS).
4. Zapieczętuj płytkę optycznie przejrzystą folią przylepną.
   UWAGA: Płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C, jeśli nie zostaną odczytane natychmiast. Przed odczytem należy doprowadzić zapieczętowane płytki do temperatury pokojowej, aby zapobiec kondensacji pary wodnej, która mogłaby zafałszować pomiary spektrofotometryczne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
podłoże Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065
Surowica cielęca płodowa – Optima, inaktywowana ciepłem (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
200 mM L-glutaminy (L-glut)	Gibco	25030-081
Czarnie polistyrenowe mikropłytki 96-dołkowe z płaskim, przezroczystym dnem, traktowane TC	Corning	3603
bufor fosforanowy (PBS)	Gibco	10010-023
TempPlate RT folia optycznie przezroczysta	USA Scientific	2978-2700
Pożywka z obniżoną zawartością surowicy Opti-MEM	Gibco	31985-070