Generowanie rekombinowanego lentiwirusa w komórkach ssaków

Streszczenie

Źródło: Zhang, Y., et al., Direct Reprogramming of Mouse Fibroblasts into Melanocytes. J. Vis. Exp. (2021)

W niniejszym materiale wideo zaprezentowano produkcję i zagęszczanie rekombinowanego lentiwirusa w komórkach ssaków, co umożliwia wydajną dostawę genów czynników transkrypcyjnych lub innych elementów genetycznych w zastosowaniach takich jak przeprogramowanie komórkowe, badania funkcjonalne oraz potencjalne badania terapeutyczne.

Protokół

1. Konstrukcja skoncentrowanego systemu pakowania lentiwirusów dla czynników transkrypcyjnych

1. Produkcja stężonego wirusa (Rysunek 1A, B)
   1. Wysiać 1,5 × 10⁶ Komórki HEK (human embryonic kidney)-293T wysiać do szalki 60 mm i hodować w medium podstawowym (patrz Tabela 1) w 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2₂.
      UWAGA: Jeśli wirus ma być pakowany w partiach, można zastosować 100-mm szalkę do hodowli komórkowej (szczegóły w tabeli Tabela 2).
   2. Po 24 h, w dniu transdukcji, należy upewnić się, że komórki HEK-293T osiągnęły 80–90% konfluencji, a następnie zastąpić pożywkę 3,5 ml DMEM (pożywka Eagle’a modyfikowana przez Dulbecco) (150 µL DMEM na 1 cm2²). Pozostawić komórki w 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem i zawartością 5% CO2₂ przez 2 h.
      UWAGA: Medium zamienny musi być bezzsórkowaty, aby komórki mogły zostać "zagłodzone" w celu lepszej transfekcji plazmidowej.
   3. Przygotować mieszaninę plazmidów (mieszanina A) zawierającą 3 µg plasmidów docelowych Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 lub Snai2; 1 µg plazmidu pakującego PMD2.G oraz 2 µg plazmidu pakującego PSPAX2. Objętość mieszaniny A uzupełnić do 150 µL z DMEM bez surowicy. Przygotować mieszaninę odczynnika do transfekcji (mieszanina B), dodając 12 µL odczynnika do transfekcji (objętość odpowiada dwukrotności całkowitej masy wszystkich plazmidów), a następnie uzupełnić objętość mieszaniny B do 150 µL bezsurowicznym DMEM.
      UWAGA: Podczas przygotowywania mieszanin należy powoli dodawać ciecz, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.
   4. Po odstawieniu mieszanin A i B na 5 min w temperaturze pokojowej, należy je połączyć. Mieszaninę inkubować w temperaturze pokojowej przez 20–30 min w celu utworzenia kompleksów transfekcyjnych.
   5. Wyjąć komórki HEK-293T z inkubatora, wymienić pożywkę na DMEM + 2% FBS (płodowa surowica bydlęca), dodać kroplami mieszaninę z kroku 1.1.4, a następnie delikatnie wymieszać ciecz.
   6. Po 8 h wymienić pożywkę na 3,5 ml pożywki normalnej. Po wymianie pożywki zbierać nadsącz wirusowy po 24 h oraz 48 h.
   7. Wymieszać nadsączki wirusa zebrane w dwóch różnych punktach czasowych. Wirować z prędkością 200 × g przez 5 min w temperaturze 4 °CPrzefiltrować nadsącz przez 0.45 µm filtry i zebrać w sterylnej probówce stożkowej o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Wirus zebrany po 24 h można przechowywać w temperaturze 4 °C i zmieszany z wirusem zebranym po 48 h.
   8. Skoncentrować nadsącz wirusowy poprzez wirowanie przy 6000 × g przy 4 °C przez noc (~16 h). Po wirowaniu należy upewnić się, że na dnie probówki stożkowej widoczny jest osad wirusowy.
   9. Powoli odlać nadsącz. Rozpuścić pellet wirusa w objętości pożywki normalnej stanowiącej 1/100^th objętości nadsączu wirusowego. Za pomocą mikropipety P1000 delikatnie pipetuj ciecz w górę i w dół, aż do uzyskania homogenicznej mieszaniny. Rozdziel skoncentrowanego wirusa do probówek do mikrocentryfugi zgodnie z potrzebami. Przechowywać w temperaturze −80 °C.
      UWAGA: Metoda ta pozwala na 100-krotne zagęszczenie wirusa. Zagęszczony wirus (100x) może być przechowywany przez >1 rok w temp. −80 °CNależy unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania wirusa.

Tabela 1: Składniki pożywek standardowej i do przeprogramowania.

	Składniki	Dawka (stężenie, objętość)	Stężenie końcowe
Pożywka podstawowa (100 mL)	DMEM/HIGH GLUCOSE	89 mL
	FBS inaktywowany ciepłem	10 mL
	Antybiotyki (Pen/Strep)	10000 U/mL, 1 mL	100 U/mL
Pożywka do reprogramowania (100 mL)	RPMI-1640	88 mL
	FBS inaktywowany ciepłem	10 mL
	Rekombinowany ludzki SCF	200 μg/mL, 50 μL	100 ng/mL
	Rekombinowany ludzki bFGF	4 μg/mL, 250 μL	10 ng/mL
	Rekombinowana ludzka insulina	10 mg/mL, 50 μL	5 μg/mL
	Ludzki EDN3	100 μM, 100 μL	0.1 μM
	Toksyna choleryczna	0.3 mg/mL, 0.56 μL	20 pM
	12-mirystynian 13-octan forbolu (TPA)	1 mM, 20 μL	200 nM
	Hydrokortyzon	100 μg/mL, 500 μL	0.5 μg/mL
	Adenina	40 mg/mL, 60 μL	24 μg/mL

Tabela 2: Szczegóły systemu pakowania lentiwirusów.

Naczynie hodowlane	Gęstość wysiewu (komórek/naczynie)	Pożywka (mL)	System plazmidowy			Odczynnik do transfekcji (µL)
			Plazmid docelowy (μg)	PMD2.G (μg)	PSPAX2 (μg)
35 mm	6 ×105	1.5	1.5	0.5	1	6
60 mm	1.5 × 106	3.5	3	1	2	12
100 mm	4 × 106	8	8	3	6	34

Wyniki

Rycina 1: Produkcja skoncentrowanego wirusa i szacowanie miana. (A) Intensywność fluorescencji GFP (zielonego białka fluorescencyjnego) po zainfekowaniu komórek HEK-293T nieskoncentrowanym lentiwirusem (1x) oraz skoncentrowanym lentiwirusem (100x) (B) Porównanie wskaźników infekcji nieskoncentrowanego lentiwirusa (1x) i skoncentrowanego lentiwirusa (100x) wykryte za pomocą cytometrii przepływowej. (C) Szacowanie miana skoncentrowanego lentiwirusa. Paski skali = 250 µm. Skróty: GFP = zielone białko fluorescencyjne; TU = jednostki transdukcyjne.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Filtr 0.45 μM	Millipore	SLHVR33RB
Etanol 95%/100%	LANBAO	210106	Przechowywać w temp. pokojowej
Antybiotyki (Pen/Strep)	Gibco	15140-122	Przechowywać w temp. -20 °C
Przeciwciało anty-TRP2/DCT	Abcam	ab74073	Gospodarz/Izotyp: Rabbit IgG Reaktywność gatunkowa: mysz/człowiek Rozcieńczenie do użycia 1:200
DMEM (wysoka zawartość glukozy)	HyClone	SH30243.01	Przechowywać w temp. 4 °C
DMSO	Sigma	D2650	Przechowywać w temp. pokojowej
FBS	Gibco	10270-106	Przechowywać w temp. -20 °C Inaktywować termicznie przed użyciem
Żelatyna	Sigma	G9391	Przechowywać w temp. pokojowej
Plazmidy GFP-PURO (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 i Snai2)	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	Przechowywać w temp. -20 °C
Hematoksylina	Abcam	ab220365	Przechowywać w temp. pokojowej
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Odczynnik do transfekcji, przechowywać w temp. 4 °C
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	Przechowywać w temp. pokojowej
Forbol 12-mirystynian 13-octan (TPA)	Sigma	P8139	Stężenie zapasu 1 mM Stężenie końcowe 200 nM
Polybrene	Sigma	H9268	Kationowy polimerowy odczynnik do transfekcji; stężenie zapasu 8 μg/µL Stężenie końcowe 4 ng/µL
Puromycyna	Gibco	A11138-03	Przechowywać w temp. -20 °C
Rekombinowany ludzki bFGF	Invitrogen	13256-029	Stężenie zapasu 4 μg/mL Stężenie końcowe 10 ng/mL
Rekombinowana ludzka insulina	Sigma	I3536	Stężenie zapasu 10 mg/mL Stężenie końcowe 5 µg/mL