W niniejszym filmie zaprezentowano sposób transfekcji ludzkich komórek tetracistronicznym plazmidem minigenomu imitującym genom wirusa Ebola wraz z plazmidami pomocniczymi. Wewnątrz komórek dochodzi do ekspresji białek wirusowych oraz lucyferazy, co prowadzi do montażu i pączkowania niepatogennych, zdolnych do replikacji cząstek wirusopodobnych.
Artykuł metodologiczny
Produkcja zawierających reporter cząstek wirusopodobnych wirusa Ebola zdolnych do transkrypcji i replikacji
36 wyświetleń
⸱
30 września 2026
W tym artykule
Streszczenie
Protokół
1. Transfekcja komórek producentów w celu wstępnej produkcji cząstek wirusopodobnych kompetentnych do transkrypcji i replikacji (trVLPs)
- 24 hr po rozdzieleniu komórek (patrz Rysunek 1 w celu uzyskania przeglądu harmonogramu eksperymentu), przenieś DNA plazmidowego (ilości podano w Tabeli 1) do sterylnej probówki kriogenicznej o pojemności 2 mL, używając końcówek z filtrem. Do DNA dodaj 100 µL OptiMEM na każdą studzienkę. Krótko wymieszaj mieszaninę na wirówce typu vortex i delikatnie odwiruj zawartość probówek w mikrocentry fudze. Jeśli kilka studzienek ma zostać przetransfekowanych identycznymi plazmidami, można przygotować master mix dla kilku studzienek.
- Przed użyciem krótko wymieszaj na vortexie fiolkę z Transit LT1. Do rozcieńczonego DNA dodaj 7,5 µL Transit LT1 na każdą studzienkę. Delikatnie wymieszaj mieszaninę na vortexie, dbając, aby ciecz nie osadziła się na nakrętce probówki kriogenicznej, a następnie inkubuj przez 15 min w temperaturze pokojowej.
- Delikatnie wymieszaj kompleksy transfekcyjne, pipetując w górę i w dół. Do każdej studzienki dodawaj kroplami po 100 µL kompleksów transfekcyjnych. Kołysz płytkę w przód/tył oraz z boku na bok, aby rozprowadzić kompleksy transfekcyjne. Nie obracaj płytki kolistym ruchem, ponieważ spowoduje to nierównomierne rozprzestrzenienie kompleksów.
- Przenieś komórki z powrotem do inkubatora.
- Po 24 hr usuń supernatant z komórek. Do komórek dodaj 4 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) z 5% FBS (Fetal Bovine Serum), 2 mM L-glutaminą i 1x pen/strep (Penicillin/Streptomycin) (DMEM5). Ten krok można wykonać dla maksymalnie 3 studzienek jednocześnie bez ryzyka ich wyschnięcia, pod warunkiem, że studzienki zawierają identyczne próbki (w przeciwnym razie, ze względu na zdolność do samowzmacniania trVLP (Transcription- and Replication-Competent Virus-Like Particles) w tym systemie, może dojść do kontaminacji krzyżowej, dlatego krok ten należy wykonywać pojedynczo dla każdej studzienki).
- Przenieś komórki z powrotem do inkubatora.
Tabela 1. Ilości DNA do transfekcji. Ilość każdego plazmidu wymaganą do transfekcji komórek producentów i komórek docelowych podano w ng na studnię płytki 6-dołkowej.
| Komórki producenta (p0) | Komórki docelowe (p1 i wyższe) | |
| pCAGGS-NP | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP35 | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP30 | 75 | 75 |
| pCAGGS-L | 1,000 | 1,000 |
| p4cis-vRNA-RLuc | 250 | - |
| pCAGGS-T7 | 250 | - |
| pCAGGS-Tim1 | - | 250 |
Wyniki
Rysunek 1. Harmonogram tetracistronowego testu trVLP dla 3 kolejnych pasaży. Dni wysiewania komórek (s), transfekcji komórek (t), zakażania komórek (i), zmiany pożywki (c) oraz zbioru komórek i trVLP (h) są zaznaczone dla trzech kolejnych pasaży (wskazane strzałkami).
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kolba do hodowli komórek 75 cm² | Corning | 430641 | |
| DMEM | Sigma | D6546 | Podgrzać do 37°C przed użyciem |
| FBS | Life technologies | 26140-079 | Inaktywować termicznie przez 30 min w 56°C |
| L-Glutamina | Life Technologies | 25030-081 | 100x |
| Pen/strep | Life Technologies | 15070-063 | 100x |
| Płytki 6-dołkowe | Costar | 3516 | |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 |
